第一部分短暫性葉酸缺乏聯(lián)合小分子化合物促進鼠胚成纖維細胞重編程的研究 目的研究短暫性葉酸缺乏聯(lián)合新型小分子化合物組合在細胞重編程中是否可以減少外源性重編程因子的使用,提高iPS細胞的誘導效率。 方法使用新的小分子化合物組合(丁酸鈉,A-83-01, CHIR99021, Y-27632)聯(lián)合短暫性葉酸缺乏共同作用小鼠胚胎成纖維細胞,在4因子SKOM、3因子SKO、2因子OK、1因子O的作用下誘導細胞重編程。 結果小分子組合聯(lián)合短暫性葉酸缺乏提高了4因子和3因子的重編程效率,同時在只有2因子OK的條件性下,產(chǎn)生了小鼠iPS細胞,從而無需使用Sox2和c-Myc。所得到的細胞系與小鼠ES細胞在增殖率、形態(tài)、多能性相關標記物和基因的表達方面均相似,并具有多向分化潛能。 結論短暫性葉酸缺乏聯(lián)合小分子化合物可提高iPS細胞誘導效率,進一步減少外源性重編程因子的使用。 第二部分無飼養(yǎng)層、無血清條件下非整合質(zhì)粒重編程HDFa成iPS細胞的研究 目的研究在無飼養(yǎng)層、無血清條件下利用非整合附著體質(zhì)粒載體和電轉染技術誘導成人皮膚成纖維細胞為多潛能干細胞(induced pluripotent stem, iPS)的研究,試圖構建臨床級iPS細胞誘導體系。 方法將凍存的成人真皮成纖維細胞復蘇,在無飼養(yǎng)層、無動物血清條件下,采用Amaxa電轉儀和lonza公司基本成纖維細胞專用電轉液電轉染,轉染后鋪于六孔板中,分別于24h、1周、2周、3周、4周利用熒光顯微鏡觀察EGFP熒光表達情況；利用編碼OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, shRNA P53基因的非整合附著體質(zhì)粒載體組合對成人真皮成纖維細胞進行重編程,并對誘導所得的iPS細胞進行形態(tài)、功能及核型鑒定。 結果轉染成人真皮成纖維細胞后,熒光顯微鏡下觀察到成纖維細胞呈綠色熒光表達,提示電轉染成功,轉染效率約為50-60%,且隨著時間延長,其熒光表達逐漸減弱,提示附著型載體會逐漸丟失。在無飼養(yǎng)層、無動物血清條件下,利用非整合質(zhì)粒電轉染成人真皮成纖維細胞,我們從3×105細胞中獲得30個iPS細胞,獲得的iPS細胞具有和胚胎干細胞相似的形態(tài),保持未分化狀態(tài),免疫熒光和熒光定量PCR多能性檢測均為陽性,核型分析結果為正常細胞核型,畸胎瘤檢測示具有分化為三個胚層的能力。 結論采用Amaxa電轉儀和lonza公司基本成纖維細胞專用電轉液電轉染成人真皮成纖維細胞,在無飼養(yǎng)層無動物血清條件下,可將外源基因EGFP有效的轉入細胞核內(nèi),且隨著時間延長,其熒光表達逐漸減弱,可以滿足重編程前期轉基因高表達后期逐漸不表達的需要；利用附著體質(zhì)粒載體組合電轉染成人真皮成纖維細胞可以得到臨床應用級別的iPS細胞,為將來的iPS細胞臨床治療研究奠定了基礎。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R329

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 羅祥基;程慶保;徐峰;譚蔚鋒;姜小清;張柏和;王紅陽;吳孟超;;慢病毒介導基于microRNA系統(tǒng)的HBs RNAi技術抑制HBV復制[J];第二軍醫(yī)大學學報;2009年03期

2 熊永潔;尹波;肖連臣;王倩;甘莉;張逸馳;張?zhí)K明;;Proliferation and Differentiation of Neural Stem Cells Co-Cultured with Cerebral Microvascular Endothelial Cells after Oxygen-glucose Deprivation[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年01期

3 閆秋月;邱占東;胡文濤;方瑜;李婧;陳勤;張?zhí)K明;;葉酸缺乏的鼠胚成纖維細胞誘導為iPS細胞的實驗研究[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2013年02期

本文編號：2815678