第一部分短暫性葉酸缺乏聯(lián)合小分子化合物促進(jìn)鼠胚成纖維細(xì)胞重編程的研究 目的研究短暫性葉酸缺乏聯(lián)合新型小分子化合物組合在細(xì)胞重編程中是否可以減少外源性重編程因子的使用,提高iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。 方法使用新的小分子化合物組合(丁酸鈉,A-83-01, CHIR99021, Y-27632)聯(lián)合短暫性葉酸缺乏共同作用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,在4因子SKOM、3因子SKO、2因子OK、1因子O的作用下誘導(dǎo)細(xì)胞重編程。 結(jié)果小分子組合聯(lián)合短暫性葉酸缺乏提高了4因子和3因子的重編程效率,同時(shí)在只有2因子OK的條件性下,產(chǎn)生了小鼠iPS細(xì)胞,從而無(wú)需使用Sox2和c-Myc。所得到的細(xì)胞系與小鼠ES細(xì)胞在增殖率、形態(tài)、多能性相關(guān)標(biāo)記物和基因的表達(dá)方面均相似,并具有多向分化潛能。 結(jié)論短暫性葉酸缺乏聯(lián)合小分子化合物可提高iPS細(xì)胞誘導(dǎo)效率,進(jìn)一步減少外源性重編程因子的使用。 第二部分無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)血清條件下非整合質(zhì)粒重編程HDFa成iPS細(xì)胞的研究 目的研究在無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)血清條件下利用非整合附著體質(zhì)粒載體和電轉(zhuǎn)染技術(shù)誘導(dǎo)成人皮膚成纖維細(xì)胞為多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem, iPS)的研究,試圖構(gòu)建臨床級(jí)iPS細(xì)胞誘導(dǎo)體系。 方法將凍存的成人真皮成纖維細(xì)胞復(fù)蘇,在無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)動(dòng)物血清條件下,采用Amaxa電轉(zhuǎn)儀和lonza公司基本成纖維細(xì)胞專用電轉(zhuǎn)液電轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后鋪于六孔板中,分別于24h、1周、2周、3周、4周利用熒光顯微鏡觀察EGFP熒光表達(dá)情況；利用編碼OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, shRNA P53基因的非整合附著體質(zhì)粒載體組合對(duì)成人真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程,并對(duì)誘導(dǎo)所得的iPS細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)、功能及核型鑒定。 結(jié)果轉(zhuǎn)染成人真皮成纖維細(xì)胞后,熒光顯微鏡下觀察到成纖維細(xì)胞呈綠色熒光表達(dá),提示電轉(zhuǎn)染成功,轉(zhuǎn)染效率約為50-60%,且隨著時(shí)間延長(zhǎng),其熒光表達(dá)逐漸減弱,提示附著型載體會(huì)逐漸丟失。在無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)動(dòng)物血清條件下,利用非整合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染成人真皮成纖維細(xì)胞,我們從3×105細(xì)胞中獲得30個(gè)iPS細(xì)胞,獲得的iPS細(xì)胞具有和胚胎干細(xì)胞相似的形態(tài),保持未分化狀態(tài),免疫熒光和熒光定量PCR多能性檢測(cè)均為陽(yáng)性,核型分析結(jié)果為正常細(xì)胞核型,畸胎瘤檢測(cè)示具有分化為三個(gè)胚層的能力。 結(jié)論采用Amaxa電轉(zhuǎn)儀和lonza公司基本成纖維細(xì)胞專用電轉(zhuǎn)液電轉(zhuǎn)染成人真皮成纖維細(xì)胞,在無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)動(dòng)物血清條件下,可將外源基因EGFP有效的轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi),且隨著時(shí)間延長(zhǎng),其熒光表達(dá)逐漸減弱,可以滿足重編程前期轉(zhuǎn)基因高表達(dá)后期逐漸不表達(dá)的需要；利用附著體質(zhì)粒載體組合電轉(zhuǎn)染成人真皮成纖維細(xì)胞可以得到臨床應(yīng)用級(jí)別的iPS細(xì)胞,為將來(lái)的iPS細(xì)胞臨床治療研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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2 熊永潔;尹波;肖連臣;王倩;甘莉;張逸馳;張?zhí)K明;;Proliferation and Differentiation of Neural Stem Cells Co-Cultured with Cerebral Microvascular Endothelial Cells after Oxygen-glucose Deprivation[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年01期

3 閆秋月;邱占東;胡文濤;方瑜;李婧;陳勤;張?zhí)K明;;葉酸缺乏的鼠胚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年02期

本文編號(hào)：2815678