近年來,由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的愈演愈烈的禽流感疫情給中國及其它國家養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失,并嚴重威脅著人類健康。H9N2是AIV一種亞型,不僅在全世界范圍的禽類中廣泛流行,而且可以感染人,同時還是97年香港禽流感感染人事件的H5N1 AIV內(nèi)部基因的供體。在H9N2預(yù)防與免疫相關(guān)研究中,針對病毒的單鏈抗體(single chain antibody fragment,scFv)因其具有分子量小、穿透力強及與抗原結(jié)合力強而備受青睞。本研究從NCBI基因庫中獲得針對H9N2 AIV的PB2蛋白的scFv序列,擬利用具有天然表達優(yōu)勢的大腸桿菌體廉價制備H9N2 AIV的單鏈抗體。由于scFv自身結(jié)構(gòu)特殊,其在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物基本以包涵體形式存在,經(jīng)過變性和復性過程后,蛋白活性極低。本實驗將通過基因工程方法,結(jié)合表達條件優(yōu)化和過程優(yōu)化,促進H9N2AIVscFv在大腸桿菌中實現(xiàn)可溶性表達,并初步檢測其與抗原PB2的結(jié)合能力。該實驗首先合成針對H9N2 AIV scFv基因序列的引物,通過利用套疊PCR的方式獲得H9N2 AIV scFv基因片段序列,構(gòu)建至pET23a-T、pET23a-sfGFP-MAN載體中,獲得重組質(zhì)粒pET23a-scFv、pET23a-sfGFP-scFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta Blue菌株中,誘導表達后,經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)H9N2AIVscFv基因序列與超折疊綠色熒光蛋白(sfGFP)融合表達后,scFv可以獲得部分可溶性表達,而未融合sfGFP的scFv即使經(jīng)過改變溫度、誘導劑濃度、培養(yǎng)周期,也未見可溶性表達。本實驗進一步通過套疊PCR的方式合成了 H9N2 AIV的PB2蛋白基因,并將其克隆到真核表達載體pcDNA-DsRed載體上,獲得重組真核表達質(zhì)粒pcDNA-PB2-DsRed,通過Lipfectin3000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至HEK293T細胞表達PB2蛋白。將大腸桿菌中表達的scFv提取并純化,與pcDNA-PB2-DsRed轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western Blot)和細胞免疫熒光實驗檢測發(fā)現(xiàn),通過大腸桿菌獲得的針對H9N2的可溶性scFv能與表達的PB2蛋白進行特異性識別,初步顯示我們利用大腸桿菌獲得的針對H9N2 AIV可溶性scFv具有生物活性,為進一步以該單鏈抗體建立緊急免疫接種和檢測診斷方法奠定了理論基礎(chǔ)。
【學位單位】：湖北大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

感病毒Ｈ９Ｎ２亞型作為新型禽流感病毒的基因供體逡逑實，禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亞型可與多種亞型重配，包括高致病性的Ｈ圖１．邋２所示［５９］。類Ｇ１型的Ｈ９Ｎ２禽流感病毒可能是導致１９９７年Ｈ５Ｎ１亞型病毒的６個內(nèi)部基因供體；同樣也為２０１３年在中國Ｎ８病毒亞型提供了邋６個內(nèi)部基因［６Ｇ］。此外，禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亞型配，導致了多種基因型的禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亞型。逡逑Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｎｈｕｉ／ＳＣ７０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑８０邋－邋Ａ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑Ａ／ｅｒＭｒｏｎｍｅｎｔ／２ｈｅｊｉａｎｇ／ｌ８／２０１３＜ＨＳ邋Ｎ２）逡逑｜邋Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈ６ｊｉａｎｇ／ＳＤ０３３／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑，Ａ／Ａｎｈｕｉ／１－ＤＥＷＨ７３０／２０１３（Ｈ７Ｎ９）逡逑１邋00邋－邋Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｙｎａｎ／Ｓ４１１１／２０１１邋（Ｈ９Ｎ２）逡逑｜—￣邐——Ａｙｊｔａｎｇｘｉ－Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３（Ｈ１０Ｎ８）逡逑ＬＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈｅ｜ｊａｎｇ／３２ｇ／２0ｌｌ（Ｈ９Ｎ２｝逡逑邐——

１ｆｅＬ逡逑Ｓ邐ｈａ２X4逡逑圖１．邋１邋Ｈ９Ｎ２禽流感病毒抗原性相關(guān)的氨基酸三維圖逡逑禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亞型作為新型禽流感病毒的基因供體逡逑宄證實，禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亞型可與多種亞型重配，包括高致病性的Ｈ６Ｎ１，邋Ｈ６Ｎ１，如圖１．邋２所示［５９］。類Ｇ１型的Ｈ９Ｎ２禽流感病毒可能是導致１９９７年香港爆發(fā)流感Ｈ５Ｎ１亞型病毒的６個內(nèi)部基因供體；同樣也為２０１３年在中國大陸出現(xiàn)Ｈ１０Ｎ８病毒亞型提供了邋６個內(nèi)部基因［６Ｇ］。此外，禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亞型多次與Ｈ９Ｎ生重配，導致了多種基因型的禽流感病毒Ｈ７Ｎ９亞型。逡逑

單鏈抗體是一種富含二硫鍵的蛋白質(zhì)，其功能活性依賴于二硫鍵的正確形成。二于單鏈抗體形成具有正常免疫功能的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象是必需的。一般情況而言，菌細胞質(zhì)內(nèi)以硫氧還蛋白通路為主，胞質(zhì)內(nèi)表達的單鏈抗體中硫醇基處于還原無法形成二硫鍵，從而很難獲得具有生物活性的單鏈抗體。大腸桿菌細胞周質(zhì)中環(huán)境可促使硫醇基氧化，形成正確的二硫鍵，一般的方法誘導表達的量及其有限。逡逑有研究報道利用大腸桿菌獲得禽流感單鏈抗體，但由于單鏈抗體的自身結(jié)構(gòu)特點桿菌的表達蛋白的特征，大腸桿菌表達的禽流感單鏈抗體在胞內(nèi)形成致密的包涵逡逑只有經(jīng)過裂解細胞，將包涵體溶解在變性劑中，通過復性得才能得到可溶性禽流抗體蛋白，實驗流程如圖２．１所示。但這種方法主要的缺陷是：復性時需要經(jīng)過的稀釋去掉變性劑，然后進一步濃縮，過程繁瑣，復性得率低（＜１５％）；另外，逡逑繁瑣的復性步驟獲得的禽流感可溶性單鏈抗體蛋白正確的空間構(gòu)象不一定１００％進而影響其正常的生物活性，包括免疫活性。逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2815540