目的:應激是機體在遭受各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激時所出現(xiàn)的非特異性全身反應,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要組成部分,在受到外界刺激時會發(fā)生錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白的蓄積,從而影響細胞的正常生理功能,形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,而GRP78、ATF6、CHOP是發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志性蛋白。下丘腦是下丘腦-垂體-腎上腺軸的主要組成部分,也是應激反應的重要調(diào)節(jié)中樞,而弓狀核和室周核是下丘腦兩個主要的多巴胺能神經(jīng)核團,多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)在應激中發(fā)揮重要作用,因此探究應激反應中的下丘腦多巴胺神經(jīng)核團的病理變化具有重要意義。本研究旨在觀察不同時程應激對大鼠下丘腦弓狀核和室周核神經(jīng)細胞的影響、TH的表達變化以及多巴胺能神經(jīng)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白的表達變化,為應激性損傷的機制研究提供病理形態(tài)學依據(jù)。方法:1本實驗采用6周齡、體重為(200±20)g的SD雄性大鼠,將60只大鼠隨機分組,組別為實驗1天、3天、7天、14天、21天組及各相應時間點的正常對照組,每組大鼠6只。建立束縛固定加冰水游泳應激大鼠模型,將大鼠每日仰臥位束縛固定6小時(8:00-14:00)同時禁食水,束縛結束后進行5分鐘冰水游泳。應激各組進行束縛及冰水游泳處理時,對照組大鼠于飼養(yǎng)籠中禁食水,其余時間各組大鼠自由進食、飲水。模型建立后,各實驗組及相應對照組大鼠于次日處死,留取血清做ELISA檢測,腦組織經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、連續(xù)切片等處理后留做各種染色使用。1)記錄各組大鼠體重的變化。2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immuno sorbent Assay,ELISA)檢測血清中糖皮質(zhì)激素濃度水平的變化。3)硫堇染色觀察下丘腦弓狀核和室周核神經(jīng)細胞尼氏體變化及細胞形態(tài)學改變。4)免疫組織化學染色觀察多巴胺能神經(jīng)細胞陽性表達變化,同時采用全景組織細胞定量分析系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。5)免疫熒光多重染色觀察多巴胺神經(jīng)內(nèi)TH與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白共表達變化。2統(tǒng)計學分析:運用全景組織細胞定量分析系統(tǒng)的HistoQuest~?軟件(TissueGnostics,Vienna,Austria)對TH陽性細胞數(shù)目進行計數(shù)統(tǒng)計。利用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,所有數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標準差(Mean±SD)”表示,采用單因素方差分析(ANOVA),用最小顯著差法作兩兩比較,以P0.05為有顯著統(tǒng)計學差異。結果:1.大鼠體重變化結果隨實驗時程的延長,對照組大鼠體重呈上升趨勢。與正常對照組相比,實驗1天組大鼠體重略有下降,隨處理時間的延長,實驗組大鼠體重也呈上升趨勢,但增速小于各組相應正常對照組大鼠。2.血清糖皮質(zhì)激素ELISA檢測結果與正常對照組大鼠相比,實驗組大鼠血清中糖皮質(zhì)激素水平從第3天開始明顯升高,7天組達到峰值,14天組依然維持在較高水平,21天時顯著性降低,與正常對照組相比無明顯差異。3.硫堇染色結果實驗結果顯示各時間點正常對照組無明顯差異。分別在200倍和100倍顯微鏡下對各組下丘腦弓狀核和室周核進行觀察顯示,正常對照組神經(jīng)細胞尼氏體位于細胞質(zhì)內(nèi),分布均勻,較豐富,實驗1天、3天組尼氏體無明顯變化,7天組部分神經(jīng)細胞出現(xiàn)水腫、尼氏體結構不清,14天組部分細胞尼氏體消失、神經(jīng)細胞固縮,21天組尼氏體消失及固縮的神經(jīng)細胞數(shù)目增多。4.免疫組織化學染色結果(1)下丘腦弓狀核內(nèi)TH免疫組織化學觀察與計數(shù)實驗觀察顯示各時間點正常對照組無明顯差異。使用HistoQuest軟件(TissueGnostics,Vienna,Austria)在200倍顯微鏡下,分別對各組弓狀核內(nèi)TH陽性細胞數(shù)進行統(tǒng)計。與正常對照組相比,應激1天、3天組陽性細胞數(shù)目無明顯差異;應激7天、14天和21天組陽性細胞數(shù)目減少,且隨著應激時程的延長數(shù)目逐漸減少。(2)下丘腦室周核內(nèi)TH免疫組織化學觀察與計數(shù)實驗觀察顯示各時間點正常對照組無明顯差異。使用HistoQuest軟件(TissueGnostics,Vienna,Austria)在100倍顯微鏡下,分別對各組室周核內(nèi)TH陽性細胞數(shù)進行統(tǒng)計。與正常對照組陽性細胞數(shù)目相比,應激1天、3天組陽性細胞數(shù)目無明顯差異;應激7天、14天和21天組陽性細胞數(shù)目明顯減少,且隨著應激時程的延長陽性細胞數(shù)目逐漸減少。5.免疫熒光多重染色結果(1)下丘腦弓狀核免疫熒光染色共表達結果1)下丘腦弓狀核TH與GRP78共表達結果與正常對照組相比,應激1天組共表達陽性細胞無明顯差異,3天組急劇升高,7天組共表達陽性細胞數(shù)目下降,隨著應激時程的延長,陽性細胞數(shù)目逐漸減少,21天組與正常對照組相比無明顯差異。2)下丘腦弓狀核TH與ATF6共表達結果與正常對照組相比,應激1天組共表達陽性細胞無明顯差異,3天組開始升高,隨著應激時程的延長,共表達陽性細胞數(shù)目逐漸升高,14天組達到峰值,21天時陽性細胞數(shù)目下降,與對照組相比無明顯差異。3)下丘腦弓狀核TH與CHOP共表達結果與正常對照組相比,應激1天組共表達陽性細胞無明顯差異,3天組明顯升高,隨著應激時間的延長在14天達到高峰,21天時略有下降,仍明顯高于正常對照組。(2)下丘腦室周核免疫熒光染色共表達結果1)下丘腦室周核TH與GRP78共表達結果與正常對照組相比,應激1天組共表達陽性細胞無明顯差異,3天組急劇升高,7天組共表達陽性細胞數(shù)目下降,隨著應激時程的延長,陽性細胞數(shù)目逐漸減少,14天、21天組與正常對照組相比無明顯差異。2)下丘腦室周核TH與ATF6共表達結果與正常對照組相比,應激1天組共表達陽性細胞無明顯差異,3天時開始升高,且隨著應激時程的延長在14天組達到峰值,在21天時陽性細胞數(shù)目下降,但仍明顯高于正常對照組。3)下丘腦室周核TH與CHOP共表達結果與正常對照組相比,應激1天組共表達陽性細胞無明顯差異,3天、7天組共表達陽性細胞數(shù)目有所上升,14天達到高峰,21天有所下降,但仍明顯高于正常對照組。結論:本實驗成功建立了大鼠束縛加冰水游泳應激模型,通過觀察硫堇特殊染色、免疫組織化學、免疫熒光多重染色結果以及對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析得出以下結論:較長時程的反復應激刺激可導致大鼠下丘腦弓狀核和室周核神經(jīng)細胞的損傷以及多巴胺能神經(jīng)細胞的缺失,多巴胺神經(jīng)細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、ATF6、CHOP與TH共表達的變化提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能參與了下丘腦多巴胺能神經(jīng)細胞的損傷。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R338
【部分圖文】：

25附 圖圖1 下丘腦弓狀核最大冠狀面Fig.1 The section with the largest area of the arcuate nucleus in thehypothalamusSchematic diagram of AN(a). Representative section TH immunohistochemistry in the ANat the level of -3.24 mm from the Bregma (b).Bar=2 mm.圖 2 下丘腦室周核最大冠狀面Fig.2 The section with the largest area of the periventricular nucleus in thehypothalamusSchematic diagram of Pe (a). Representative section TH immunohistochemistry in the Pe atthe level of -1

圖1 下丘腦弓狀核最大冠狀面Fig.1 The section with the largest area of the arcuate nucleus in thehypothalamusSchematic diagram of AN(a). Representative section TH immunohistochemistry in the ANat the level of -3.24 mm from the Bregma (b).Bar=2 mm.

不同時程束縛加冰水游泳刺激對大鼠體重的影響

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 郝彥利;陳英華;董為人;;中晚期孕期束縛應激對子代下丘腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育的影響[J];中國臨床解剖學雜志;2012年06期

本文編號：2814911