[研究目的]目前心血管疾病(CVD)仍是全球疾病導(dǎo)致死亡的主要原因,而我國(guó)心血管疾病占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位。已有臨床試驗(yàn)表明,內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)的抑制劑——不對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)和單甲基精氨酸(L-NMMA)可競(jìng)爭(zhēng)抑制NOS的結(jié)合位點(diǎn),減少內(nèi)源性一氧化氮(NO)的產(chǎn)生,導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙和心血管相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展,如高脂血癥、糖尿病、高血壓、心力衰竭等。人體ADMA的濃度在一個(gè)狹窄的范圍內(nèi),ADMA濃度的升高與增加心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)�，F(xiàn)階段檢測(cè)ADMA的方法比較復(fù)雜且耗時(shí),為ADMA檢測(cè)帶來(lái)了困難。相比于鼠單克隆抗體,兔單克隆抗體具有更高的親和力和高特異性、識(shí)別更多的新型表位、可識(shí)別鼠源蛋白抗體等優(yōu)點(diǎn),故制備抗ADMA的兔單克隆抗體,可用來(lái)改善目前ADMA的檢測(cè)技術(shù),也可為其他臨床小分子標(biāo)志物單克隆抗體的制備提供新思路和幫助。同時(shí)也為臨床醫(yī)師提供準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定及可靠的檢測(cè)結(jié)果,為心血管相關(guān)疾病的早期診斷、治療提供新的依據(jù)。[實(shí)驗(yàn)方法]1、動(dòng)物免疫與抗體效價(jià)檢測(cè)使用KLH-SMCC-Cys-ADMA免疫新西蘭大白兔,在檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況的同時(shí),采集兔子外周血進(jìn)行流式細(xì)胞分析,檢測(cè)是否有抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生;采用ELISA以及Western blot進(jìn)行免疫特異性和抗體效價(jià)分析。2、抗體可變區(qū)及恒定區(qū)序列的獲取將兔子淋巴結(jié)和脾臟處理成單個(gè)細(xì)胞,流式分選出特異性漿細(xì)胞和B細(xì)胞,提取總RNA,利用cDNA5'末端快速擴(kuò)增技術(shù)(5'RACE),合成cDNA,進(jìn)行PCR獲取可變區(qū)序列以及恒定區(qū)序列。3、獲取抗體輕鏈和重鏈表達(dá)框?qū)⑿蛄姓_的恒定區(qū)進(jìn)行PCR,利用靶向選擇性聯(lián)合PCR(TS-jPCR)技術(shù)連接抗體可變區(qū)和恒定區(qū),構(gòu)建輕鏈和重鏈的表達(dá)框,用于下一步蛋白表達(dá)。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]1、流式細(xì)胞分析顯示在免疫前,2只兔子體內(nèi)的抗原特異性B細(xì)胞百分比分別為0.946%和0.403%、抗原特異性漿細(xì)胞分別占0.403%和0.881%,存在少量的抗原特異性細(xì)胞。免疫后產(chǎn)生的特異性漿細(xì)胞和B細(xì)胞的百分比較免疫前有所增加,說(shuō)明兔子經(jīng)過(guò)免疫體內(nèi)產(chǎn)生一定量的抗原特異性細(xì)胞。2、western blot免疫特異性分析顯示,發(fā)現(xiàn)在64kD附近產(chǎn)生特異性條帶,進(jìn)行抗體滴度檢測(cè),1:50000稀釋后非特異性結(jié)合減少,表明兔子經(jīng)過(guò)免疫后產(chǎn)生的抗ADMA抗體特異且效價(jià)較高。3、ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)結(jié)果顯示,免疫后的OD值是免疫前OD值的2倍以上,即有差異,表明兔子免疫后產(chǎn)生特異性抗體同時(shí)測(cè)得效價(jià)高達(dá)1:50000。4、從摘取兔子的淋巴結(jié)和脾臟細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選中,分選出抗原特異.性細(xì)胞利用5' RACE技術(shù)獲取其可變區(qū)與恒定區(qū)序列,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)可變區(qū)出現(xiàn)特異性條帶。5、恒定區(qū)經(jīng)測(cè)序結(jié)果顯示,輕鏈恒定區(qū)與參考序列完全相符,重鏈恒定區(qū)與參考序列差兩個(gè)氨基酸。獲取恒定區(qū)表達(dá)載體框?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳得出輕鏈的條帶約在4000bp附近,重鏈的條帶約在5000bp附近,與理論值接近。[結(jié)論]1、本課題使用的抗原能使兔子體內(nèi)產(chǎn)生抗ADMA特異性抗體。設(shè)計(jì)的引物可成功獲取抗ADMA抗體輕鏈和重鏈的恒定區(qū)序列,使用TS-jPCR連接抗體可變區(qū)和恒定區(qū),構(gòu)建輕鏈和重鏈的表達(dá)框,為下一步蛋白表達(dá)打下基礎(chǔ)。2、可利用5' RACE技術(shù)獲取抗體輕鏈和重鏈的可變區(qū)的序列,為后續(xù)獲取單細(xì)胞可變區(qū)序列和進(jìn)一步建立臨床檢驗(yàn)ADMA的方法打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392-33
【部分圖文】：

去上清，再用１％的ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液輕輕重懸。逡逑）空白對(duì)照：取細(xì)胞懸液２０００于ＥＰ管中，然后加入５００（ｉｌ的１％邋ＢＳＡ－ＰＢ，置于冰上，避光，準(zhǔn)備上機(jī)。逡逑）熒光條件的設(shè)置（見(jiàn)圖２－ｌ）：Ｒｌ為總淋巴細(xì)胞，Ｒ２為漿細(xì)胞（ＩｇＧｌｏｗＥＲｈｉｇｇａｔｅ），然后由Ｒ２再細(xì)分到第３張圖，Ｒ３為抗原特異性漿細(xì)胞，Ｃｓ（ＩｇＧｌｏｗＥＲｈｉｇｈ邋ａｎｔｉｇｅｎｍｉｄ）；邋Ｒ４邋為抗原特異性邋Ｂ邋細(xì)胞，即邋ＡＳＢＣｓ邋（ＩｇＧｌｏｇｅｎｈｉｇｈ），邋Ｒ３邋和邋Ｒ４邋均為所需細(xì)胞。通道設(shè)置：ＦＬ－１：邋ＦＩＴＣ－Ａｈｘ－Ｃｙｓ－ＡＤＭ色，ＦＩＴＣ的激發(fā)波長(zhǎng)為４９５ｎｍ，發(fā)射波長(zhǎng)為５１９ｎｍ，邋—般選用波長(zhǎng)為４８８ｎｍ４：邋ＧｔＡｎｔｉ－ＲｂＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（通道為ＰＥｃｙ５．５紅光激發(fā)波長(zhǎng)為６４９ｎｍ，發(fā)射波７２ｎｍ）；邋ＦＬ－７：邋ＥＲ－ｔｒａｃｋｅｒ邋Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ邋ＤＰＸ邋（藍(lán)光，激發(fā)波長(zhǎng)約為邋３７４邋ｎｍ波長(zhǎng)在４３０和６４０邋ｎｍ之間出現(xiàn)逡逑

（３）二抗孵育：加二抗（羊抗兔ＩｇＧ－ＨＲＰ，１：５０００稀釋），室溫２５°Ｃ孵育１小逡逑時(shí)。洗板液洗板３次，每次５ｍｉｎ，拍干。逡逑（４）加底物顯色：ＡＢＴＳ？底物每孔１０００。輕輕搖勻，室溫避光１０分鐘，加終逡逑止液每孔５０４。逡逑（５）結(jié)果記錄：ＡＢＴＳ？底物顯色后，使用酶標(biāo)儀在４０８ｎｍ波長(zhǎng)讀取吸光度值。逡逑三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑１、流式分析結(jié)果逡逑２只兔子免疫前和４次免疫后進(jìn)行流式細(xì)胞分析，檢測(cè)是否產(chǎn)生抗原特異性逡逑細(xì)胞，每次流式分析結(jié)果見(jiàn)下圖：逡逑

圖２－３：第２８天流式分析ａ為１號(hào)兔?

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2808591