【摘要】：目的:紅系發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的多階段過程,歷經(jīng)早期祖細(xì)胞分化,終末分化以及網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟,然而這一發(fā)育過程可能會(huì)受到諸多因素的影響,導(dǎo)致原有的正常發(fā)育過程發(fā)生異常。骨髓增生異常綜合征(MDS)是一類與紅系發(fā)育障礙密切相關(guān)的疾病,主要表現(xiàn)為紅系、粒系和巨核細(xì)胞系中的一系或多系發(fā)育異常。研究發(fā)現(xiàn)在MDS患者中STAG2是高頻突變的基因之一,表明STAG2的表達(dá)及功能異常可能在MDS發(fā)病和惡性演進(jìn)中起著重要作用。為研究STAG2在紅系發(fā)育中的功能作用,本課題基于shRNA干擾基因表達(dá)的方法,篩選出STAG2敲低的K562、HEL及CD34~+細(xì)胞,其中K562和HEL細(xì)胞可通過特殊的誘導(dǎo)方式向紅系分化,而CD34~+造血干細(xì)胞同樣可向紅系分化并能到達(dá)細(xì)胞脫核階段。通過敲低STAG2,檢測(cè)其對(duì)紅系發(fā)育進(jìn)程的影響,有助于理解正常紅系發(fā)育及MDS發(fā)病相關(guān)紅系發(fā)育障礙的機(jī)理。方法:首先對(duì)STAG2及其家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析,包括進(jìn)化關(guān)系、蛋白結(jié)構(gòu)及基因信息等。其次構(gòu)建STAG2的shRNA表達(dá)型載體,以得到STAG2敲低的K562、HEL以及CD34~+細(xì)胞。然后用氯化高鐵血紅素(Hemin)誘導(dǎo)STAG2敲低的K562和HEL細(xì)胞,使其向紅系分化,自誘導(dǎo)后連續(xù)四天分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、聯(lián)苯胺染色檢測(cè)血紅蛋白、Annexin V/PI雙染色流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡和PI染色流式檢測(cè)細(xì)胞周期。針對(duì)STAG2敲低的CD34~+細(xì)胞,在促紅細(xì)胞生成素(EPO)誘導(dǎo)其向紅系分化的培養(yǎng)體系中,第6天以IL-3R、GPA、CD34和CD36為細(xì)胞表面標(biāo)志物,流式檢測(cè)紅系祖細(xì)胞BFU-E和CFU-E的分化。其后以GPA、band3和α4-integrin為細(xì)胞表面標(biāo)志物,從第7天至第15天每隔一天檢測(cè)細(xì)胞的終末分化。最后在第15天和第17天時(shí),用syto16熒光染料檢測(cè)細(xì)胞的脫核。結(jié)果:首先STAG2及其家族基因位于不同的染色體上,蛋白都含有STAG和SCD結(jié)構(gòu)域,氨基酸序列較為相似,但從進(jìn)化樹的分析結(jié)果來看,它們?cè)诩棺祫?dòng)物的演化中出現(xiàn)了分離。其次得到了STAG2敲低的K562、HEL和CD34~+細(xì)胞,并用qRT-PCR驗(yàn)證了敲低效率。誘導(dǎo)K562和HEL細(xì)胞向紅系分化的結(jié)果顯示,STAG2敲低組的細(xì)胞生長變慢,分化延遲,細(xì)胞凋亡增加,而細(xì)胞周期無顯著性變化。在CD34~+細(xì)胞的紅系分化培養(yǎng)體系中,第6天STAG2敲低組的BFU-E增多,CFU-E減少,GPA表達(dá)降低,第7天與第9天STAG2敲低組的GPA表達(dá)水平依舊低于對(duì)照組,但在第11天至第15天的檢測(cè)中,對(duì)照組與STAG2敲低組的GPA、band 3和α4-integrin基本趨于一致,表明STAG2敲低主要延遲紅系祖細(xì)胞的分化。最后在細(xì)胞脫核的檢測(cè)中,STAG2敲低組的syto16陰性細(xì)胞低于對(duì)照組,表明STAG2敲低導(dǎo)致細(xì)胞脫核率的降低。結(jié)論:1.STAG2及其同家族蛋白結(jié)構(gòu)相似,都含有STAG和SCD結(jié)構(gòu)域,氨基酸序列相似度較高,但它們?cè)诩棺祫?dòng)物的演化中出現(xiàn)了分離。2.在STAG2敲低的紅系發(fā)育過程中,細(xì)胞的增殖減慢,凋亡增加,紅系祖細(xì)胞分化延遲以及細(xì)胞脫核率減少。因此,在紅系發(fā)育過程中,STAG2參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及脫核等多種重要生物學(xué)事件。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)示意圖（摘自文獻(xiàn)[4]）

紅細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路（摘自文獻(xiàn)[34]）

造血譜系分化圖（摘自文獻(xiàn)[43]）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 姜立,馬文麗;人紅白血病K562細(xì)胞與紅系分化的調(diào)控[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年06期

本文編號(hào)：2799975