本文關(guān)鍵詞：沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的研制與初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：沙門菌種類繁多,已知的血清型已有2600多種,嚴重影響人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展,對沙門菌的檢測和診斷是防控沙門菌病的重要手段之一。沙門菌致病島2(Salmonella pathogenicity island 2, SPI-2)的基因編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)促進沙門菌病。沙門菌在細胞內(nèi)的復制發(fā)生在沙門菌膜性小泡(SCV)中,并且通過毒力島2 T3SS轉(zhuǎn)移大約30個效應(yīng)蛋白到宿主膜性系統(tǒng)及細胞質(zhì)中。由沙門菌毒力島2編碼的效應(yīng)蛋白SpiC對于沙門菌在宿主吞噬性細胞內(nèi)的存活起重要作用,它是在沙門菌中發(fā)現(xiàn)的第一個宿主轉(zhuǎn)運干擾蛋白,能被SPI-2 T3SS導出細菌并進入宿主細胞胞質(zhì)中,并與宿主細胞的蛋白互作,抑制吞噬體和溶酶體的融合。spiC基因在NCBI序列比對后發(fā)現(xiàn),是在沙門菌中特有的,并且同源性在99%-100%。單克隆抗體技術(shù)作為現(xiàn)代生命科學研究的重要工具,在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究方面以及免疫學診斷方面有著不可或缺的作用。因此,篩選具備沙門菌特異性阻斷效果的單克隆抗體,研發(fā)競爭ELISA檢測試劑(盒),為沙門菌的檢測和沙門菌病的診斷提供快速、有效的技術(shù)手段勢在必行。本研究以純化的重組融合蛋白rHis-SpiC為免疫原,免疫6-8周齡的BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合,以純化的重組融合蛋白rGST-SpiC為檢測原,經(jīng)過間接ELISA檢測和多次亞克隆,共獲得7株能穩(wěn)定分泌SpiC蛋白特異性抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為3G9、3B2、4D9、4F7、5F8、6H2、6B9。對所制備的7株單克隆抗體進行亞類測定,結(jié)果顯示7株SpiC單克隆抗體其中5株為IgG1,2株為IgG2a;對7株單克隆抗體進行腹水效價測定,結(jié)果它們的腹水ELISA效價均很高,在1×105-1×107之間：單克隆抗體的特異性鑒定結(jié)果顯示7株單抗均與SpiC蛋白發(fā)生反應(yīng),而與其他蛋白不發(fā)生反應(yīng)。Western blotting鑒定結(jié)果顯示,7株SpiC單克隆抗體均可與rGST-SpiC和rHis-SpiC發(fā)生特異性反應(yīng),出現(xiàn)目的條帶大小一致的特異性條帶,而與重組菌BL21 (pGEX-6p-1)和BL21 (DE3)(pET)無特異性反應(yīng)。將沙門菌點在硝酸纖維素膜(NC膜)上,利用單抗的特異性建立Dot-ELISA方法,以檢測沙門菌,結(jié)果顯示,單抗僅能與沙門菌發(fā)生特異性反應(yīng),而不和非沙門菌發(fā)生特異性反應(yīng)。用該方法共檢測189株菌株,其中陽性為173株,陰性為16株,與stn檢測結(jié)果一致。以純化后的融合蛋白GST-SpiC作為包被抗原,并根據(jù)7株單抗的特性和腹水效價,挑選出單抗5F8作為競爭抗體建立了檢測SpiC蛋白抗體的競爭ELISA方法。經(jīng)過蛋白包被濃度、抗體稀釋濃度、血清稀釋度、最適封閉液、競爭時間等條件的優(yōu)化,最終建立了靈敏度高、特異性好的競爭ELISA方法,并利用該方法對感染沙門菌的雞血清進行檢測。用該方法檢測了雞血清149份,結(jié)果顯示,共檢出121份陽性樣品,檢出率為81.21%,陰性樣品28份,檢出率為18.79%。玻板凝集試驗共檢出陽性樣品數(shù)為70,陽性檢出率為46.98%,陰性樣品79,檢出率為53.02%,本研究建立的競爭ELISA方法具有簡單、快速、靈敏度高等特點,可以被廣泛用于雞血清中沙門菌抗體水平的檢測。綜上所述,本研究共成功制備了7株能穩(wěn)定分泌沙門菌SpiC蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株,7株單抗均可特異性識別原核表達系統(tǒng)表達的SpiC蛋白,具有較好的特異性和免疫反應(yīng)性,為SpiC的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了重要試劑,同時在沙門菌檢測和沙門菌病的診斷研究以及各種新型疫苗和診斷試劑的研發(fā)方面具有重要應(yīng)用價值。
【關(guān)鍵詞】：沙門菌 SpiC蛋白 單克隆抗體 競爭ELISA
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4;R392
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 符號說明8-10
• 文獻綜述10-21
• 1 沙門菌的特點和危害10-11
• 2 沙門菌檢測方法11-15
• 3 SpiC蛋白研究進展15-16
• 參考文獻16-21
• 第一章 沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的研制和鑒定21-34
• 1 材料21-22
• 2 方法22-27
• 2.1 抗原SpiC蛋白的制備22-23
• 2.2 單克隆抗體的制備23-26
• 2.3 SpiC單克隆抗體的鑒定26-27
• 3 結(jié)果27-31
• 3.1 免疫原制備27
• 3.2 檢測原制備27
• 3.3 雜交瘤細胞株的建立27-28
• 3.4 單抗亞類以及腹水效價鑒定結(jié)果28-29
• 3.5 腹水的純化29-30
• 3.6 單抗與重組蛋白的特異性鑒定30
• 3.7 Western blotting分析30-31
• 4 討論31-32
• 參考文獻32-34
• 第二章 沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的初步應(yīng)用34-48
• 1 材料34
• 2 方法34-37
• 2.1 單抗與沙門菌的特異性反應(yīng)34-35
• 2.2 Dot-ELISA檢測沙門菌35
• 2.3 檢測沙門菌抗體的單抗競爭ELISA方法35-37
• 3 結(jié)果37-43
• 3.1 單抗Dot-ELISA的特異性37
• 3.2 Dot-ELISA檢測沙門菌結(jié)果37-38
• 3.3 檢測沙門菌抗體的單抗競爭ELISA方法38-43
• 4 討論43-46
• 參考文獻46-48
• 全文小結(jié)48-49
• 致謝49-50
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學術(shù)論文50-51

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本文編號：279917