【摘要】：容積調(diào)控陰離子通道(Volume Regulated Anion Channel,VRAC)是一種在細(xì)胞體積擴(kuò)大時(shí)被激活的陰離子通道。VRAC在人體組織中表達(dá)廣泛并具有重要的生理功能。當(dāng)細(xì)胞體積擴(kuò)大時(shí),VRAC被激活并產(chǎn)生稱為細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積減小(regulatory volume decrease,RVD)的過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞體積的保護(hù)。VRAC與細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和肥胖等一系列病理、生理過(guò)程密切相關(guān)。近年來(lái),已經(jīng)有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別發(fā)現(xiàn)LRRC8A的同源異聚體是VRAC的分子基礎(chǔ),但其激活機(jī)制尚不清楚。有文獻(xiàn)表明,細(xì)胞內(nèi)鈣可能參與VRAC的激活,本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果也證實(shí),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)局部鈣濃度改變時(shí)會(huì)影響VRAC的激活。而細(xì)胞發(fā)生腫脹時(shí)伴隨著細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的上升。我們知道細(xì)胞內(nèi)的磷脂酶C(PLC)信號(hào)通路的激活會(huì)誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣的的釋放和細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的上升。由此我們推測(cè)PLC通路可能參與VRAC的激活。本課題專注于PLC通路對(duì)VRAC激活的影響。實(shí)驗(yàn)分為兩部分:第一部分主要建立了YFP-HEK293A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,以及使用激光共聚焦、電生理膜片鉗和FLIPR等技術(shù)對(duì)該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證,作為接下來(lái)評(píng)價(jià)PLC亞型對(duì)VRAC激活影響的實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ);第二部分主要借助FLIPR系統(tǒng)和YFP-H293A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行高通量篩選(high throughout screening,HTS)實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察使用si RNA沉默不同PLC亞型對(duì)VRAC功能的影響,接著使用電生理膜片鉗和qPCR的方法來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,以探索不同PLC亞型對(duì)VRAC激活的貢獻(xiàn)。第一部分:YFP-HEK293A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及VRAC功能檢測(cè)平臺(tái)的建立。目的:獲得對(duì)鹵素離子敏感的YFP-HEK293A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并使用包括HTS平臺(tái)在內(nèi)的方法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中VRAC的功能來(lái)驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。方法:1搭建YFP-H148Q-I152L質(zhì)粒并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入空白HEK293A細(xì)胞。獲得表達(dá)YFP的HEK293A細(xì)胞。2使用滅瘟素處理HEK293A細(xì)胞,獲得死亡曲線,確定最小致死濃度為15μg/mL;將YFP-H148Q-I152L瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293A細(xì)胞,使用無(wú)限稀釋法獲得單個(gè)細(xì)胞;使用含有15μg/mL滅瘟素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)獲得YFP-HEK293A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。3使用激光共聚焦、FLIPR和電生理膜片鉗等方法驗(yàn)證建立的YFP-HEK293A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的功能。結(jié)果:1.建立的YFP-HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系在共聚焦488 nm光源下可激發(fā)熒光,在不同批次(N=7)的實(shí)驗(yàn)中,YFP陽(yáng)性的細(xì)胞比率在90.46%±8.34(N=7);而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染YFP時(shí)YFP陽(yáng)性細(xì)胞的比率為23.67%±11.56(N=6)。另外,細(xì)胞處于低滲條件時(shí)(激活VRAC)加入NaI溶液,兩種轉(zhuǎn)染類型的細(xì)胞熒光強(qiáng)度均下降(進(jìn)入細(xì)胞的I~-對(duì)熒光的淬滅),且10μM的DCPIB(VRAC阻斷劑)能顯著阻斷這一熒光降低過(guò)程。2.電生理實(shí)驗(yàn)中,在VRAC被低滲外液激活的條件下,穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系在-60 mV鉗制電壓下的電流密度為118.71±14.56 pA/pF(n=9);空白HEK293A的電流密度為103.24±11.38 pA/pF(n=13);兩者無(wú)顯著性差異,表明YFP的表達(dá)并不影響VRAC電流密度。且兩者在低滲條件下誘導(dǎo)的VRAC電流,均能被10μM的DCPIB抑制。3.在FLIPR的高通量熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,在低滲及I~-存在的條件下,穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染YFP的細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低百分比分別為90.68%±4.92(n=34)和92.13%±3.35(n=25),兩者無(wú)顯著性差異。在7μM的U73122(PLC阻斷劑)和10μM的DCPIB存在的情況下,由低滲及I~-誘發(fā)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的熒光強(qiáng)度降低由原來(lái)的93.34%±5.45(n=12)分別降低為54.43%±7.68(n=21,*P0.05)和25.61%±3.93(n=18,**P0.01)。結(jié)論:激光共聚焦、膜片鉗和FLIPR高通量熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:建立的YFP-HEK293熒光蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系并不影響HEK293細(xì)胞內(nèi)在的VRAC特性,其表現(xiàn)出與空白HEK293A類似的VRAC特性:在低滲細(xì)胞外液條件下5 min左右VRAC完全開(kāi)放,且可被VRAC阻斷劑DCPIB阻斷,穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系成功建立;FLIPR高通量熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)VRAC的開(kāi)放。第二部分:磷脂酶C亞型在VRAC激活中的作用。目的:利用基因沉默的方法來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)不同PLC亞型對(duì)VRAC激活的影響,利用qPCR的方法確定si RNA的敲除效率。方法:1將靶向不同PLC亞型的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入YFP-HEK293A穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,降低相應(yīng)PLC亞型的表達(dá)。2使用q PCR技術(shù),檢測(cè)各個(gè)PLC亞型的敲除效率。3使用FLIPR儀器進(jìn)行高通量熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn),通過(guò)對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)尋找可影響VRAC功能的PLC亞型。4進(jìn)行電生理膜片鉗實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證高通量熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。結(jié)果:1.PLC阻斷劑U73122在膜片鉗、FLIPR和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)中均能顯著抑制VRAC通道激活,表明PLC可能參與了VRAC的激活2.qPCR的結(jié)果顯示,利用相應(yīng)siRNA干擾PLCβ3、PLCβ1、PLCζ1、PLCδ4、PLCδ3、PLCβ4、PLCγ1、PLCλ2、PLCη1和PLCχδ1等10種亞型后,PLC亞型表達(dá)分別降低54.12%、61.26%、67.86%、57.21%、51.43%、59.56%、49.67%、71.24%、65.67%和55.12%。3.在FLIPR的高通量熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),低滲誘導(dǎo)的空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度均顯著降低,與低滲誘導(dǎo)的空白對(duì)照組87.63%±8.54(n=48)相比,敲低PLCγ1、PLCβ3、PLCβ1、PLCδ3、PLCδ4、PLCχδ1和PLCλ27種亞型后低滲及NaI誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度降低分別為37.66%±4.68(n=18,*P0.05)、38.12%±6.89(n=18,*P0.05)、51.68%±9.56(n=17,*P0.05)、33.57%±5.46(n=17,**P0.01)、22.51%±4.65(n=18,*P0.05)、41.78%±11.54(n=12,*P0.05)和44.51%±8.86(n=17,*P0.05),VRAC的激活受到不同程度影響;而敲低PLCβ4、PLCη1、PLCζ1、PLCε1、PLCχδ2、PLCβ2、PLCη2和PLCλ1后低滲及NaI誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度降低分別為84.78%±11.23(n=17)、80.24%±13.45(n=18)、80.6%±13.53(n=12)、81.33%±11.35(n=18)、86.74%±9.69(n=12)、81.67±9.79(n=17)和84.33%±11.43(n=12),與空白對(duì)照組均無(wú)差異。4.在膜片鉗實(shí)驗(yàn)中,在敲低PLCγ1、PLCβ3、PLCβ1、PLCδ3、PLCδ4、PLCχδ1和PLCλ2等PLC亞型的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系上進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相比于空白對(duì)照組低滲細(xì)胞外液條件誘發(fā)的VRAC電流密度明顯減小,分別為22.54±4.32 pA/pF(n=13,*P0.05)、29.68±5.62 pA/pF(n=12,**P0.01)、27.24±6.23 pA/pF(n=14,**P0.01)、35.27±8.62 pA/pF(n=13,*P0.05)、21.65±3.38 pA/pF(n=17,***P0.001)、20.35±7.24 pA/pF(n=13,**P0.01)和32.47±7.64 p A/p F(n=11,**P0.01),而低滲誘導(dǎo)的空白對(duì)照組、使用含有無(wú)效序列siRNA處理的陰性對(duì)照組(scramble siRNA組)、PLCζ1、PLCβ4和PLCη1組細(xì)胞電流密度分別為128.65±21.34 pA/pF(n=11)、145.32±17.88 pA/pF(n=7)、132.92±28.75pA/pF(n=9)、113.93±19.85 pA/pF(n=8)、98.49±19.75 p A/p F(n=9)。結(jié)論:PLCγ1、PLCβ3、PLCβ1、PLCδ3、PLCδ4、PLCχδ1和PLCλ2等七種PLC亞型可能參與了VRAC的激活。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2795813