【摘要】：研究背景在20世紀70年代,斑馬魚作為模式生物首次進入人們的視野。斑馬魚具有體積小、繁殖快、易于養(yǎng)殖、生命周期短、體外受精及發(fā)育、胚胎透明等眾多獨特的生物學優(yōu)勢,并且其與人類基因的同源性高達87%。憑借這些特點,斑馬魚作為新興的模式生物,迅速成為越來越多科學研究者的新寵。近年來,隨著相關生物學技術的不斷發(fā)展與完善,斑馬魚在各個研究領域的應用模型也逐步建立起來。比如藥物篩選與安全評估模型、免疫系統(tǒng)模型、微生物侵染模型、心血管發(fā)育與疾病模型、白血病模型以及組織再生模型等。這些模型的建立為相關疾病發(fā)生機制和防治手段的研究提供了極大的便利。造血是指血液中各種血細胞的生成、發(fā)育與成熟,它是從胚胎發(fā)育時期就開始的,貫穿生物體一生,持續(xù)不斷地產生并補充血液系統(tǒng)的過程。成熟血細胞包括紅細胞、巨核細胞、血小板、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷(nature killer, NK)細胞。各種血細胞對機體正常生理功能的維持均具有重要作用,例如紅細胞具有運氧功能,白細胞參與機體炎癥和防御反應,淋巴細胞參與免疫反應等。目前,人們已發(fā)現多種惡性疾病與血細胞發(fā)育缺陷密切相關,比如各類貧血、白血病和惡性淋巴瘤等等。因此,研究造血發(fā)育能夠幫助人們更深入地理解這些血液相關疾病的發(fā)生過程及機理,從而為臨床診斷及治療提供指導意義。脊椎動物的造血發(fā)育大致可分為兩個階段：原始造血階段和定向造血階段。原始造血的主要作用是產生能夠為機體提供氧氣的紅細胞,以滿足早期胚胎快速生長的需要。定向造血出現在發(fā)育階段的晚些時期,其顯著特點是隨著發(fā)育時間的改變,其位置也發(fā)生相應的變化。定向造血階段生成造血干細胞,它具有多能性,能夠分化產生機體所需的全部譜系的血細胞。在脊椎動物中,定向造血階段的HSCs主要來自于胚胎的主動脈-性腺-中腎區(qū)域,隨后,它們遷移至胎肝,最終進入骨髓,為機體終生造血。斑馬魚中的造血發(fā)育過程與哺乳動物十分相似,同樣包含原始造血和定向造血兩個階段。由腹側中胚層形成的中央細胞群是產生原始紅系祖細胞的組織,而前部側向中胚層被認為是原始髓系造血的位點。在受精后30h,在背主動脈腹側壁區(qū)域開始產生造血干細胞,標志著定向造血階段的開始,這些造血干細胞隨后逐漸遷移至尾部造血組織,最后定居在腎臟,為機體終生造血。造血發(fā)育是一個復雜有序的動態(tài)過程,受到多個轉錄因子的調控。原始造血過程主要由Gatal和Pu.1兩個調控因子所調控,它們之間呈現出相互拮抗的關系,共同調節(jié)原始紅系和髓系的命運分化。其中Gatal標記原始紅系造血,而Pu.1則標記原始髓系造血。在定向造血階段主要的調控因子有Runxl和Cmyb等,它們同時也是造血干細胞的標記物。此外,其他的造血發(fā)育階段標記基因還包括標記定向紅系造血的ael和βe1,標記定向髓系造血的lcp1,特異性標記中性粒細胞的mpx和lyz,特異性標記巨噬細胞的mfap4和mpegl,以及標記定向淋系造血的gata3、ikaros、rag1和rag2等。髓系過氧化物酶(MPO)早在20世紀40年代便被發(fā)現,然而直到多年之后,其功能才逐漸被人們所認知。MPO是哺乳動物血紅素過氧化物酶家族成員之一,主要儲存在中性粒細胞的初級顆粒中。當機體遭受損傷或微生物入侵時,MPO從中性粒細胞的顆粒中釋放出來,發(fā)揮免疫作用。通常,人們認為MPO的主要功能是通過產生活性氧,特別是次氯酸,從而發(fā)揮其殺菌作用。體外實驗已經清楚地證明,MPO及其底物H202和鹵素能夠組成一個強有力的抑制并殺滅細菌和真菌的系統(tǒng)。近年來,隨著人們對MPO了解的不斷深入,越來越多的證據表明MPO的功能不僅僅局限于殺菌,而是更為廣泛。MPO同樣參與細胞內的穩(wěn)態(tài)調節(jié),并且在多種炎癥疾病的發(fā)生和形成過程中發(fā)揮重要作用。由于MPO能夠參與機體內多個生化過程,從而發(fā)揮各種不同的生物學功能,因此MPO與多種人類疾病的產生和發(fā)展都有著較為密切的關系。MPO缺陷病人在機體免疫能力低下的情況下更容易受到各類微生物,尤其是白色念珠菌的感染,從而引發(fā)全身性感染疾病。MPO還和多種免疫反應和慢性炎癥疾病有關。大量臨床研究表明,MPO與各種心血管疾病,特別是動脈粥樣硬化的形成密切相關。此外,MPO介導的氧化作用所引起的組織損傷在其他慢性炎癥疾病的發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用。在斑馬魚中,髓系過氧化物酶(mpx)基因主要作為中性粒細胞的特異性標記基因,用來研究中性粒細胞的生成、發(fā)育和遷移運動。然而對于其本身的功能,尤其是殺菌功能的研究卻少之又少。本研究首先通過化學誘變劑ENU誘變處理野生型AB斑馬魚雄魚(F0代),使其精原細胞發(fā)生隨機的基因突變,進而繁殖產生F1代及F2代。我們通過對F2代同家族自交產生的F3代胚胎進行造血發(fā)育相關的表型檢測,從中篩選出具有特定造血發(fā)育缺陷表型的突變體。接著,我們選擇一種具有蘇丹黑B染色陰性表型的突變體smu681進行定位克隆,找到了其突變基因mpx,同時進行了初步的表型鑒定。最后,我們對突變體smu681進行白色念珠菌侵染實驗,通過分析其侵染后的各種表型,以期能夠對髓系過氧化物酶的殺菌功能有更深入的了解。本文研究內容總共分為三個部分：第一部分為斑馬魚造血突變體的大規(guī)模篩選；第二部分為突變體smu681的突變基因定位克隆及表型鑒定；第三部分為突變體smu681的白色念珠菌侵染實驗。第一部分：斑馬魚造血突變體的大規(guī)模篩選1.目的本部分的研究主要是利用ENU誘變處理斑馬魚使其產生隨機突變,進而通過不同的表型檢測方法從中篩選出具有特定造血發(fā)育缺陷表型的突變體,并對其進行初步的分類,以用于后續(xù)進一步的研究工作。2.方法我們采用常規(guī)的ENU誘變方法,處理40條野生型AB斑馬魚雄魚,將處理后仍存活的雄魚與野生型AB雌魚交配產生F1代,進而繁殖F2代。收集F2代同家族自交產生的F3代胚胎,分別通過中性紅染色、蘇丹黑B染色和原位雜交三種不同的表型鑒定方法,篩選出造血發(fā)育缺陷的突變體。3.結果1)經過4輪誘變處理后,僅有20條雄魚存活下來。將存活的雄魚與野生型AB雌魚交配,培養(yǎng)了20個家族,總數約2000條的F1代斑馬魚。進而將F1代與野生型AB交配,總共培養(yǎng)了1564個F2家族。2)我們成功篩選了1383個F2家族,共得到52個突變體,經過互補實驗進一步分為25種。根據其表型可初步分為4個類型,其中,中性紅染色缺失突變體有5種,蘇丹黑B染色突變體有2種,中性紅和蘇丹黑B染色同時缺失的突變體有1種,βe1基因表達缺失突變體有17種。這些突變體將在以后進行詳細的基因和功能方面的研究。第二部分：突變體smu681的突變基因定位克隆及表型鑒定1.目的本部分的研究目的是通過定位克隆找到突變體smu681的突變基因,進而找到其具體的突變位點。隨后對突變體smu681進行較為詳細的表型鑒定,同時通過拯救實驗進一步驗證突變基因與表型的對應關系。2.方法我們采用常規(guī)的斑馬魚定位克隆的方法,首先構建專門用于基因作圖的家族,大量收集突變體胚胎,接著依次進行定位染色體的初步作圖和定位基因的精確作圖,最終找到突變基因及其突變位點。根據突變位點的序列特征設計基因型鑒定的方法,以便能夠清楚區(qū)分野生型、雜合突變體和純和突變體三種不同的基因型。我們通過蘇丹黑B染色、二氨基聯苯胺染色和酪氨酸信號放大染色三種不同的方法分別檢測突變體smu681的髓系過氧化物酶催化活性,利用原位雜交和熒光定量PCR技術來檢測突變體smu681中包括mpx基因在內的各譜系造血發(fā)育標記基因的表達情況。我們分別用顯微注射法直接導入mRNA和構建穩(wěn)定表達轉基因品系兩種方法來進行smu681的拯救實驗。3.結果1)初始作圖的結果將突變體smu681的突變基因定位于斑馬魚10號染色體上,精確作圖將其進一步確定為mpx基因。通過對smu681的mpx基因進行全長測序,發(fā)現其突變點位于第13個外顯子上,為三個堿基的缺失,其突變類型為無義突變,即產生了使得翻譯提前終止的終止密碼子。2)三種不同的針對髓系過氧化物酶催化活性的染色結果均表明,在突變體smu681的中性粒細胞內,髓系過氧化物酶的活性幾乎完全缺失。3)原位雜交和熒光定量PCR的結果表明,在受精后24h、36h、48h和72h這四個不同的時期,突變體smu681中mpx基因的mRNA水平遠遠低于正常情況。同時smu681的Tg(mpx:GFP)轉基因品系能夠正常表達綠色熒光,說明其轉錄活性未受影響。4)我們分別檢測了各譜系造血的代表性標記基因在smu681中的表達,分別是：標記原始髓系造血的pu.1,標記原始紅系造血的gatal,標記定向造血干細胞的c-myb,標記中性粒細胞的lyz,標記巨噬細胞的mfap4,標記定向紅系造血的βe1,標記定向淋系造血的ragl。原位雜交結果顯示這些標記基因在smu681中均能正常表達,提示突變體smu681的其他譜系造血發(fā)育基本正常。同時特別檢測了中性粒細胞特異性標記基因npsn和srgn的表達,以及觀察了smu681的Tg(lyz:DsRED2)的熒光表達情況,結果證明中性粒細胞的產生及數量未受影響。5)拯救實驗的結果表明,直接注射mpx基因的mRNA雖然能夠使其在突變體胚胎內表達,但由于其表達時間短暫,表達位置過于廣泛,因此不足以起到恢復表型的效果。而使mpx基因在髓系特異性啟動子coronin1a驅動下表達的穩(wěn)定轉基因品系則能夠一定程度上恢復突變體的表型。第三部分：突變體smu681的白色念珠菌侵染實驗1.目的本部分研究的主要目的是通過對突變體smu681進行白色念珠菌的侵染實驗,從而分析其遭受侵染后的各種表型,進而研究髓系過氧化物酶在真菌侵染過程中所發(fā)揮的作用。2.方法我們通過顯微注射法,將表達綠色熒光的白色念珠菌注射到斑馬魚胚胎的后腦室以實現侵染效果。我們分別使用三種不同劑量的白色念珠菌進行侵染實驗,通過激光共聚焦顯微鏡觀察胚胎內白色念珠菌的生長狀況,以及記錄侵染后胚胎的存活率,來評估白色念珠菌的侵染效果,并比較突變體smu681和野生型是否有所不同。我們收集真菌侵染后不同時間點的胚胎,勻漿涂板,從而進行菌落計數,以此評估侵染后不同時期胚胎內白色念珠菌的存活數量。我們通過轉基因品系斑馬魚Tg(lyz:DsRED2)來觀察并追蹤真菌侵染后不同時期的胚胎內中性粒細胞在后腦的聚集數量,并且通過熒光定量PCR檢測IL-1βmyd88和IL-8三個炎癥因子基因的表達水平,從而比較突變體smu681和野生型在遭受真菌侵染后內部的炎癥反應程度。3.結果1)通過不同劑量的真菌注射后胚胎存活情況的對比,發(fā)現高劑量真菌注射會使得全部胚胎在侵染后30h內死亡;中等劑量注射也會引起大部分胚胎出現嚴重感染并死亡,其過程比高劑量要慢；而低劑量注射則不會引起感染,且胚胎能夠在侵染后存活超過4天。對比突變體smu681和野生型胚胎,并未發(fā)現二者在真菌侵染后的生存率上有明顯的區(qū)別。2)白色念珠菌的菌落計數結果表明,侵染后24h和48h,突變體smu681胚胎內部的真菌數量要多于野生型,而到了72h,二者數量接近。這提示髓系過氧化物酶活性的缺失對于侵染早期機體內抑制白色念珠菌的生長繁殖產生了一定的影響。3)通過觀察真菌侵染后的胚胎后腦部位聚集的中性粒細胞數量,我們發(fā)現突變體smu681胚胎中所聚集的中性粒細胞數量要多于野生型,表明其內部的炎癥反應程度更為嚴重。4)通過檢測侵染后IL-1β、myd88和IL-8三個炎癥因子的表達水平,我們發(fā)現,在侵染后的突變體smu681胚胎中,IL-1β和IL-8都出現了比起野生型更為明顯的上調,而myd88所受影響相對較小。這提示髓系過氧化物酶的缺失會引起IL-1β更為強烈的表達,進而引起其下游基因IL-8的上調,從而導致更多的中性粒細胞在侵染部位的聚集。全文結論1)我們通過ENU化學誘變,成功篩選到25種斑馬魚造血缺陷突變體,并根據其表型初步分為4個類型。這表明ENU誘變篩選是一種成熟且高效的正向遺傳學篩選方法,這些突變體將在我們今后對于造血發(fā)育的研究中起到十分重要作用,并且有望建立起相應的疾病模型。2)我們通過對突變體smu681進行定位克隆,發(fā)現其突變基因為mpx。表型分析顯示smu681內部的Mpx催化活性幾乎完全缺失,而其造血發(fā)育卻基本不受影響,同時也能夠正常生長發(fā)育。這說明smu681是一種非常特異的髓系過氧化物酶缺陷突變體,適合用來進行針對Mpx活性的功能研究。3)通過對突變體smu681進行白色念珠菌侵染實驗,我們發(fā)現其侵染后胚胎的存活率與野生型相差不大,但是其內部真菌生長數量明顯較多。進一步研究發(fā)現,突變體smu681的侵染部位往往有更多的中性粒細胞聚集,同時相關炎癥因子的表達也更為強烈,表明其炎癥反應更加嚴重。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R55;R-332

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