【摘要】：研究背景和目的Cereblon(CRBN)是cullin-4 RING E3泛素連接酶(CRL4)復(fù)合體的底物受體,促進(jìn)底物蛋白與泛素分子的連接而實(shí)現(xiàn)泛素化,進(jìn)而通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)行降解底物。原癌基因蛋白c-Jun是活化蛋白Activated protein-1(AP-1)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的重要組成成分之一,AP-1活性的提高可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)。一種調(diào)控AP-1活性的機(jī)制是調(diào)控AP-1復(fù)合體各組成成分的表達(dá)以及活性,尤其是原癌蛋白c-Jun。在我們的前期工作中,我們通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CRBN過表達(dá)能夠下調(diào)c-Jun的蛋白水平。隨后的工作中我們進(jìn)一步證實(shí)了CRBN通過促進(jìn)c-Jun泛素化而對其降解。c-Jun/AP-1位于炎癥反應(yīng)信號通路的下游,因此我們猜想CRBN是否能夠通過調(diào)控c-Jun/AP-1活性而參與到炎癥反應(yīng)的調(diào)控中來。盡管目前有文獻(xiàn)報(bào)道顯示CRBN能夠調(diào)控炎癥反應(yīng),但是這一作用與CRBN組成的E3泛素連接酶的酶活功能無關(guān)。那么CRBN參與的炎癥反應(yīng)是否與CRBN及相關(guān)的E3泛素連接酶活性相關(guān)呢?在本課題中我們將通過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CRBN及相關(guān)的E3泛素連接酶是否也參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)控,其對炎癥反應(yīng)的調(diào)控是否影響細(xì)胞凋亡。研究方法構(gòu)建GFP、CRBN的穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞株。利用細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC)以及質(zhì)譜分析法對蛋白進(jìn)行定性定量分析,通過蛋白數(shù)據(jù)庫搜索獲得過表達(dá)GFP組與CRBN組的細(xì)胞中蛋白水平明顯發(fā)生變化的蛋白,發(fā)現(xiàn)CRBN明顯下調(diào)c-Jun蛋白水平。隨后我們用生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證質(zhì)譜分析的結(jié)果,通過免疫印跡法進(jìn)一步在HEK293T細(xì)胞以及CRBN敲除小鼠大腦組織中證實(shí)CRBN對c-Jun蛋白表達(dá)水平的調(diào)控。接著我們用免疫共沉淀、免疫熒光共定位及免疫印跡法檢測c-Jun與CRBN是否存在相互作用。同時(shí)用生物化學(xué)方法探究CRBN調(diào)控c-Jun蛋白泛素化、穩(wěn)定性的分子機(jī)制。在炎癥細(xì)胞中用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)、q-PCR實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡法檢測CRBN對c-Jun/AP-1活性以及炎性相關(guān)介質(zhì)如IL-1β、IL-6、i NOS和COX-2等m RNA或蛋白水平的影響,此外我們在LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中用流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)檢測CRBN對細(xì)胞凋亡的影響,并探索這一調(diào)控是否與c-Jun/AP-1有關(guān)。研究結(jié)果對前期的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)CRBN能夠下調(diào)c-Jun蛋白表達(dá)水平。通過生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)了CRBN對c-Jun的調(diào)控關(guān)系。HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)CRBN能夠明顯下調(diào)c-Jun蛋白水平,在加入蛋白酶體抑制劑MG132處理后發(fā)現(xiàn)CRBN誘導(dǎo)的c-Jun蛋白下降得到明顯回升。沉默CRBN的HEK293T細(xì)胞或CRBN敲除的小鼠大腦組織中c-Jun蛋白水平明顯上升。蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)處理后CRBN過表達(dá)組中c-Jun蛋白的半衰期明顯縮短。同時(shí)q-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CRBN并不影響c-Jun的m RNA水平。蛋白質(zhì)泛素化檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與陰性組相比,CRBN過表達(dá)后明顯增強(qiáng)c-Jun的泛素化水平,且主要形成K48位多聚泛素鏈。在炎癥細(xì)胞模型中,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),與對照組進(jìn)行對比,CRBN過表達(dá)能夠明顯下調(diào)AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。通過q-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),CRBN能夠下調(diào)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),當(dāng)細(xì)胞用NF-κB抑制劑BAY11-7082處理以及c-Jun敲低后,CRBN的過表達(dá)及敲低對炎癥反應(yīng)的調(diào)控完全受阻。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CRBN能抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究結(jié)論質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CRBN能夠調(diào)控c-Jun蛋白表達(dá)。生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRBN與c-Jun存在相互作用,并且CRBN能夠通過上調(diào)c-Jun的泛素化水平而促進(jìn)c-Jun通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,使c-Jun的穩(wěn)定性降低進(jìn)而使轉(zhuǎn)錄因子AP-1復(fù)合體活性降低,最后產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)和對抗細(xì)胞凋亡的作用。本文證實(shí)了CRBN對炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控,并闡明了其調(diào)控的分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R364.5
【圖文】：

定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定c-Jun為Cereblon(CRBN)的下調(diào)蛋白

質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明 CRBN 能夠下調(diào) c-Jun 的蛋白表達(dá)水平，接下來我們通過生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證 CRBN 對 c-Jun 蛋白表達(dá)水平的調(diào)控。為此，我們在 HEK293T 細(xì)胞中過表達(dá)pcDNA3.1或HA-CRBN質(zhì)粒（圖3.2A），或梯度過表達(dá)HA-CRBN質(zhì)粒（圖3.2B），轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)后收集細(xì)胞并裂解細(xì)胞得全細(xì)胞裂解液，所得的蛋白樣品進(jìn)行免疫印跡法檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 CRBN 能夠明顯下調(diào) c-Jun 蛋白的表達(dá)水平，同時(shí) CRBN 對c-Jun 蛋白表達(dá)的調(diào)控具有劑量依賴性。為了進(jìn)一步探究 CRBN 對 c-Jun 蛋白水平的影響，我們在 HEK293T 細(xì)胞中用兩種不同序列的 siRNA 沉默 CRBN 并檢測 c-Jun 蛋白表達(dá)水平的變化。在轉(zhuǎn)染不同序列的 siCRBN 48 h 后收集細(xì)胞并將獲得的蛋白樣品進(jìn)行免疫印跡法分析。結(jié)果顯示兩條不同的 siCRBN 均能夠有效地沉默 CRBN 基因的表達(dá)并使得 c-Jun 蛋白表達(dá)水平明顯回升（圖 3.2D）。三次生物學(xué)重復(fù)統(tǒng)計(jì)顯示siCRBN#1 的敲低效率更高，因此后面人源細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中均用這條 siCRBN 進(jìn)行敲低實(shí)驗(yàn)。此外我們將獲得的 CRBN 敲除小鼠及野生型小鼠腦組織蛋白樣品進(jìn)行 Westernblotting 驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)當(dāng) CRBN 敲除后 c-Jun 蛋白表達(dá)水平明顯升高（圖 3.2 C）。四組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)

圖 3.3 c-Jun 與 CRBN 相互作用并共定位。 c-Jun interacts and colocalizes with Ctates CRBN and (B) CRBN pulls down c-Jun in stells were treated with LPS (200 ng/mL) for 12 h ah IgG or c-Jun (or CRBN) antibody overnight. Pded to the cell lysate for purification. Cell lysates ed for c-Jun, CRBN, and/or GAPDH. Note: LPS wenous c-Jun protein level in RAW264.7 cells. (C) s were performed in HEK293T cells. HEK293T cenoblotted as described in (A and B) without LPS sRBN. HEK293 cells were transiently transfected wising lipofectamine3000 transfection reagent forith FLAG (c-Jun) and GFP antibodies for chst was used to stain the nuclei. Scale bar: 20 m.

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本文編號：2791746