【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)感染引起的慢性呼吸道傳染病,世界上三分之一的人口已被感染,每年新發(fā)病例接近九百萬(wàn)例,它在世界范圍內(nèi)傳播、發(fā)病是其盛行的原因之一。pe/ppe基因占據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因組編碼區(qū)的10%,PE/PPE蛋白家族中一些成員被鑒定為是毒力因子,參與宿主免疫反應(yīng),但大部分PE/PPE蛋白的確切功能還需要探索,其中包括PPE25、PPE27和PE19蛋白。本研究利用原核體系表達(dá)和純化獲得的PPE25、PPE27、PE19蛋白與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7相互作用以初步解析其生物功能。此外,為以后更深入地研究該家族蛋白的功能和在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中的作用,成功構(gòu)建了帶有FLAG標(biāo)簽的重組穿梭表達(dá)載體pMV261-ppe25,并電轉(zhuǎn)化至無(wú)毒快速生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌,從而獲得重組菌株。1.結(jié)核分枝桿菌PPE25、PPE27和PE19蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞因子和死亡方式的影響純化獲得重組蛋白PPE25.PPE27和PE19,去除內(nèi)毒素后經(jīng)過(guò)鱟試劑測(cè)定內(nèi)毒素含量,BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照濃度0、1.25、2.5、5.0和10.0μg/mL分別刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,作用24 h后,用Cell Proliferation ELISA BrdU (Colorimetric)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性,發(fā)現(xiàn)PPE25、PPE27和PE19對(duì)RAW264.7的活性有顯著的抑制作用(p0.05),且呈現(xiàn)劑量依賴性。重組蛋白以不同濃度作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7,作用24和48 h采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞死亡方式。結(jié)果顯示,PPE25、PPE27和PE19都導(dǎo)致RAW264.7發(fā)生細(xì)胞壞死,說(shuō)明PPE25、PPE27和PE19蛋白都具有毒性。同時(shí),應(yīng)用液體懸浮芯片系統(tǒng)luminex200方法檢測(cè)不同濃度的重組蛋白PPE25、PPE27和PE19與RAW264.7相互作用后培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的表達(dá)量的變化,從而評(píng)價(jià)PPE25、PPE27和PE19對(duì)RAW264.7炎性反應(yīng)的影響。重組蛋白PPE25、PPE27和PE19分別以1.25、2.5、5.0和10.0 μg/mL的濃度刺激RAW264.7,作用24和48h后,與空白組相比,重組蛋白PPE25引起IL-6分泌量顯著上調(diào)(p0.05),TNF-α分泌量有所上升。重組蛋白PE19引起IL-6分泌量顯著上調(diào)(p0.05),TNF-α分泌量沒(méi)有明顯差異。然而重組蛋白PPE27引起IL-6分泌量顯著下調(diào)(p0.05),TNF-α分泌量也下調(diào)。此外,重組蛋白PPE25、PPE27和PE19促使巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)量均低于檢測(cè)線2.13 pg/mL,IL-12p40表達(dá)量均低于檢測(cè)線2.09 pg/mL。這些差異表達(dá)證實(shí)重組蛋白PPE25、PPE27和PE19可以通過(guò)調(diào)控促炎性因子IL-6的表達(dá)引起巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答。2.表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ppe25基因的重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增ppe25基因序列并添加FLAG標(biāo)簽,以便Western-blot檢測(cè)其表達(dá)。將PCR產(chǎn)物定向克隆到克隆載體pCR2.1,測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的基因序列完全一致。經(jīng)BamH I/EcoR I雙酶切獲得ppe25酶切片段,克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體pMV261,通過(guò)酶切及PCR鑒定正確后,將重組質(zhì)粒pMV261-ppe25電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌mc2155感受態(tài),構(gòu)建、篩選重組恥垢分枝桿菌,命名為rMS-pMV261-ppe25。重組恥垢分枝桿菌的PCR和酶切鑒定表明構(gòu)建正確。重組菌經(jīng)45℃30min誘導(dǎo)表達(dá),超聲裂解后的Western-blot結(jié)果表明,目的蛋白與抗PPE25兔多抗血清和抗FLAG標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性的反應(yīng),與預(yù)期條帶大小39.51kD一致。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.911
【圖文】：

ＰＡＭＰｓ，其中包括脂甘聚糖（ＬＭ）、脂阿拉伯糖甘聚糖（ＬＡＭ）、脂蛋白Ｌｐ巧、ＬｐｒＧ、逡逑ＬｐｒＡ、ＭＰＴ８３、１１８９６０和￡８冷１＇－妒２－１７１。研究表明很多了８相關(guān)的蛋白傾向于與化１１２相互逡逑作用。如圖２所示，ＴＬＲ２不僅能獨(dú)自發(fā)揮作用，也可Ｗ與其他表面受體包括共同受體和逡逑輔助受體結(jié)合X椙顆涮宓氖侗鷙痛蕁；纈耄裕蹋遙被潁裕蹋遙緞饔謾⒏ㄖ芴澹茫模保村義現(xiàn)鋁τ冢蹋穡瘢�、Ｌ７w潁嗆停蹋穡潁潦侗�、而辅助受体ＣＤ３嶄Xτ詡觳猓蹋穡潁粒�。来讏A煌岷隋義細(xì)塑繅鷸值模蹋投寄芤鵓奩叵赴せ�。}停校裕福襯芤穡裕危疲�、饼x逗駝保玻穡矗板逕�，辶x喜⑶夷萇系鰨桑疲危盞嫉模停齲茫畋澩錚虼薠椙苛隋澹潁停校裕福扯嚳糲潁茫模矗韻赴某實(shí)蕁ｅ義希潁停校裕福場(chǎng)ⅲ桑疲危倩蛘擼潁停校裕福秤耄桑疲危峰濉鴯婕ぞ捺拖赴蠖寄萇系鰨危戲置謁�。总的伭x俠此擔(dān)潁停校裕福匙魑裕蹋遙布せ羆聊艿鶻諳赴蜃擁姆置諍吞岣呔轛S細(xì)胞的功能。除此Ｗ外，逡逑ＴＬＲ２調(diào)節(jié)的信號(hào)通路能引起很大范圍宿主免疫反應(yīng)用于清除ＭＴＢ，總結(jié)如圖ｌｔｉ８ｌｓＥＳＡＴ－６逡逑通過(guò)ＴＬＲ２依賴途徑瓦解宿主免疫反應(yīng)，ＭＴＢ的ＥＳＡＴ６與ＴＬＲ２胞外直接相互作用挪制逡逑巨睡細(xì)胞的ＴＬＲ信號(hào)通路。很多ＭＴＢ的ＰＥ／ＰＰＥ蛋白能與ＴＬＲ２直接相互作用，但是不逡逑同的ＰＥ／ＰＰＥ蛋白激發(fā)不同的ＴＬＲ２下游信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。ＰＰＥ３４ｔＷ激發(fā)ＴＬＲ２－Ｐ３８邋ＭＡＩ＞Ｋ信逡逑號(hào)通路并產(chǎn)生正－１０

Ｃｙｔｏｋｉｎｅ邋／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋掠準(zhǔn)品粉末溶于邋２５０邋ｎＬ邋ＳＷ邋后濃度是邋１００００邋ｐｇ／ｍＬ，按照梯逡逑度稀釋后，依次稀釋成２０００、４００、８０、１６、３．２邋ｐｇ／ｍＬ，系統(tǒng)檢測(cè)自動(dòng)生成際準(zhǔn)曲線。如逡逑圖１－５所示，各細(xì)胞因子的相關(guān)系數(shù)Ｒ２在０．９７￣１．００之間，從而保證檢測(cè)樣品的準(zhǔn)確性。逡逑ＩＬ－６逡逑W'－ＩＰ逡逑拉，４２８％，Ｒ？，０燃邐＊０．９３４逡逑巧３－邐／邐巧４－逡逑．－Ｉ邐Ｌ邐邐Ｌ邐．逡逑巧－，邐如邐如邐巧Ｓ邐巧１日１邐１0３邐巧５逡逑柳，＇邐ｐｇ／ｍｌ逡逑W'－１２ｐ４０邐ＴＮＦ－ａ逡逑議＊３欲，巧？０．~s邐ＣＶ，１７i輳螅ⅲ希憂懾義希保板澹吻桑渭滓誨義锨芍粒吻桑玻義�！儒帲＊�

本文編號(hào)：2789747