【摘要】：程序性細(xì)胞死亡受體1 (programmed cell death 1, PD1),是屬于CD28/CTLA-4家族的一種免疫受體分子,通過與其配體PD-L1或PD-L2相互作用,該分子可下調(diào)T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)通路。PD1/PD-L由的生理意義涉及到免疫應(yīng)答的各個(gè)方面,包括自身免疫、腫瘤免疫、感染免疫、抑制免疫、變態(tài)反應(yīng)和免疫自穩(wěn)等。之前,其他課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種可誘導(dǎo)表達(dá)的PD1剪接異構(gòu)體,然而這些異構(gòu)體的功能卻不是很清楚。弄清楚這些PD1異構(gòu)體的功能是研究PD1免疫調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié),且有利于為疾病治療和疫苗開發(fā)提供新的思路。最近,我們發(fā)現(xiàn)了PD1的一種新型剪接異構(gòu)體,并將其命名為A42PD1。與PD1不同,Δ42PD1不能結(jié)合PD-L1和PD-L2,也不被常用的幾株商業(yè)化PD1特異性單克隆抗體所識(shí)別�？扇苄訟42PD1 (sA42PD1)重組蛋白可在體外誘導(dǎo)PBMCs分泌前炎性細(xì)胞因子,在體內(nèi)增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞免疫反應(yīng),表明Δ42PD1是一種功能性免疫調(diào)節(jié)分子。特異性識(shí)別Δ42PD1而不識(shí)別PD1的單克隆抗體,是進(jìn)一步研究這一新發(fā)現(xiàn)的免疫分子生理功能的關(guān)鍵。本研究旨在制備鼠抗人Δ42PD1單克隆抗體,以便于對(duì)該新發(fā)現(xiàn)免疫分子的功能進(jìn)行研究。為了便于抗體的篩選,我們首先通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法分別構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人PD1和Δ42PD1的293T細(xì)胞系,通過有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞并分別命名為293T-PDl和293T-Δ42PD1,目的基因的表達(dá)通過流式細(xì)胞儀、Western blot和RT-PCR的方法得以證實(shí)。免疫原的制備,我們采用293F真核表達(dá)體系表達(dá)重組蛋白sΔ42PD1Fc(由人sΔ42PD1與兔IgG1 Fc段融合而成),通過重組proteinG來純化免疫原。采用DNA初次免疫/蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫的策略,先后用sΔ42PD1Fc重組質(zhì)粒和重組蛋白免疫BALB/c小鼠。流式細(xì)胞術(shù)分析免疫小鼠血清分別與293T-PD1和293T-A42PD1結(jié)合情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫血清與293T-A42PD1的結(jié)合顯著性高于與293T-PDl的結(jié)合,表明PDl和A42PD1分子間存在免疫原性的巨大差異。最后一次免疫后,處死免疫小鼠,取脾細(xì)胞,通過傳統(tǒng)單克隆抗體制備的方式與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。通過間接ELISA的方法篩選出兩株分泌抗人A42PD1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系,分別被命名為CH34和CH101。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,抗人A42PD1單克隆抗體CH34和CH101能特異性識(shí)別人A42PD1而不識(shí)別PD1,而Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者都能結(jié)合變性的人PD1和△42PD1但不能識(shí)別小鼠PD1。通過酵母表面展示、細(xì)胞內(nèi)染色A42PD1截短蛋白和多肽ELISA等方法鑒定出單克隆抗體CH101所識(shí)別的表位。通過PR-PCR的方法克隆了單克隆抗體CH34和CH101的重鏈可變區(qū)和輕鏈序列并進(jìn)行了測(cè)序。通過細(xì)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞術(shù)的方法,我們鑒定出CD14+單核/巨噬細(xì)胞在受到重組蛋白sΔ42PD1Fc的刺激后分泌前炎性細(xì)胞因子�？谷薃42PD1單克隆抗體CH34和CH101都不能阻斷重組蛋白sΔ42PD1Fc刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生前炎性細(xì)胞因子的過程�；�293T-A42PD1細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),A42PD1與PD1一樣,在與PBMCs表面表達(dá)的配體結(jié)合后可抑制細(xì)胞內(nèi)AKT信號(hào)通路的活化�？谷薃42PD1單克隆抗體CH34和CH101在與293T-A42PD1細(xì)胞結(jié)合后,并不會(huì)觸發(fā)A42PD1向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)。且單克隆抗體CH34和CH101也不會(huì)阻斷PBMCs表面某種未知配體對(duì)A42PD1信號(hào)通路的激活。相反,單克隆抗體CH101似乎還能夠增強(qiáng)PBMCs表面某種未知配體對(duì)A42PD1信號(hào)通路的激活作用�；诳谷薃42PD1單克隆抗體CH34和CH101,我們建立了雙抗體夾心ELISA的方法,可特異性檢測(cè)體液中sA42PD1,而不受sPD1的干擾。利用這種方法我們發(fā)現(xiàn),與健康人相比,HIV感染者血漿中sΔ42PD1水平顯著性增高。這一結(jié)果提示sΔ42PD1可能在HIV感染過程中起到一定的作用。PD1誘導(dǎo)性表達(dá)于活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞表面,通過抑制TCR和BCR信號(hào)通路調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。類似的是,Δ42PD1表達(dá)于骨髓來源的固有免疫細(xì)胞表面,可能通過其抑制性信號(hào)通路調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答。有意義的是,我們制備了抗人Δ42PD1的單克隆抗體,為深入研究其免疫功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

在９６孔板內(nèi)篩選出的嘿嶺霉素抗性單細(xì)施克隆進(jìn)行篩選。我們篩選出ＰＤ１和逡逑Ａ４２ＰＤ１分子在細(xì)胞表面表達(dá)量最高的單細(xì)胞克隆，并分別將之命名為２９化ＰＤ１逡逑和２％Ｔ－Ａ４２ＰＤ１細(xì)胞。如圖２．１Ａ所示，Ｗ邋２９３Ｔ細(xì)胞微陰性對(duì)照，２％Ｔ－ＰＤ１細(xì)逡逑胞能夠被抗ＰＤ１多克隆抗體和４種ｍＡｂ所識(shí)別。而２９３Ｔ－Ａ４２ＰＤ１細(xì)胞只能被抗逡逑ＰＤ１多克隆抗體而不能被４種ｍＡｂ所識(shí)別。這一結(jié)果表明Ａ４２ＰＤ１與ＰＤ１分子間逡逑結(jié)果有很大的差異，該結(jié)論同我們之間發(fā)表的數(shù)據(jù)相吻合。逡逑為了進(jìn)一步確證目的基因的表達(dá)，我們分別提取了邋２９３Ｔ、２９３Ｔ－Ａ４２ＰＤ１和逡逑２９化ＰＤ１細(xì)胞總ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ的方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。結(jié)果如圖逡逑２．１邋Ｂ所示，在內(nèi)參ＧＡＰＤＨ表達(dá)量相當(dāng)?shù)那闆r下，２９３Ｔ細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不到ＰＤ１逡逑和Ｍ２ＰＤ１邋ｍＲＮＡ的轉(zhuǎn)錄，２９３Ｔ－Ａ４２ＰＤ１和２９３Ｔ－ＰＤ１細(xì)胞內(nèi)，ＰＣ民擴(kuò)增出逡逑高豐度的目的基因，表明目的基因在細(xì)胞內(nèi)得到高水平的轉(zhuǎn)錄，與流式細(xì)胞術(shù)檢逡逑測(cè)到的蛋白水平的結(jié)果相一致�？傊�，Ｗ上的數(shù)據(jù)表明，篩選出來的２９３Ｔ－ＰＤ１逡逑和２ＷＴ－Ａ４２ＰＤ１單克隆細(xì)胞株能夠穩(wěn)定、高水平地表達(dá)目的蛋白

的重組蛋白ｓＡ４２ＰＤｌｈ和ｓＡ４２ＰＤ１ｈｉｓ溶解于１邋ｍｌＰＢＳ溶液中，用ＢＣＡ法測(cè)定濃度。逡逑８么４２口０１＾：和５么４２？０１１＆濃度分別為：０．７ｍｇ／ｍ巧日０．２５ｍｇ／ｍｌ。各�。玻蓿保奔兓腻义现亟M蛋白經(jīng)Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ鑒定，結(jié)果如圖２．２邋Ａ所示，在預(yù)期位置看到了ｓＡ４２ＰＤｌｐｃ逡逑和ｓＡ４２ＰＤｌｆｆｉｓ的特異性條帶，表明蛋白表達(dá)純化成功，純化的蛋白凍存于－８０°Ｃ逡逑冰箱，Ｗ備后續(xù)的免疫動(dòng)物Ｗ及分析血清效價(jià)等實(shí)驗(yàn)所用。逡逑在氨基酸序列上，人與小鼠ＰＤ１具有６０％同源性，有可能導(dǎo)致人Ａ４２ＰＤ１較逡逑難在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。因此我們采用ＤＮＡ初次免疫、蛋白逡逑加強(qiáng)免疫的免疫策略期誘導(dǎo)出較強(qiáng)的抗體反應(yīng)如圖２．２邋Ｂ所示，采用質(zhì)粒逡逑ＤＮＡ＋電穿孔的方法，分別于第０和第３周免疫２次。然后在第６和第９周分別逡逑給予重組蛋白＋弗氏佐劑加強(qiáng)免疫２次。四免后一周（初次免疫后第１０周）面靜逡逑脈采集小鼠血液，制備抗血清Ｗ便分析。由于免疫原中包含了免疫原性較強(qiáng)的兔逡逑ＩｇＧｌ邋Ｆｃ段，因此我們用Ａ４２ＰＤｌ？ｉ；取代Ａ４２ＰＤｌｐｅ包被ＥＬＩＳＡ板，分析血清Ａ４２ＰＤ１逡逑抗體的效價(jià)

２？義３鼠抗人Ａ４２ＰＤ１邋ｍＡｂ篩選逡逑免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合２周后，取培養(yǎng)上清，間接ＥＬＩＳＡ法篩選逡逑分泌Ａ４２ＰＤ１特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。結(jié)果如圖２．３邋Ａ所示，ＣＨ３４、ＣＨ３６、ＣＨ７８、逡逑ＣＨ９６和ＣＨ１０１等５個(gè)克隆的培養(yǎng)上清能夠結(jié)合Ａ４２ＰＤｌｆｆｉｓ蛋白，且吸光度值都逡逑高于陽(yáng)性對(duì)照。因此，對(duì)這５個(gè)克隆進(jìn)行亞克隆，期建立穩(wěn)定的細(xì)胞系。但在逡逑亞克隆過程中，克�。茫龋G失，沒能篩選出穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系。逡逑考慮到Ａ４２ＰＤ１胞外區(qū)與完整的細(xì)胞膜表面的Ａ４２ＰＤ１分子會(huì)有一定的差異，逡逑因此我們用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)了邋ＣＨ３４、ＣＨ３６、ＣＨ７８和ＣＨ１０１等４株ｍＡｂ逡逑對(duì)膜表面Ａ４２ＰＤ１分子的結(jié)合能力。結(jié)果如圖２．３邋Ｂ所示，Ｗ邋２９３Ｔ細(xì)胞為陰性逡逑對(duì)照，克�。茫龋常春停茫龋保埃迸c巧３Ｔ－Ａ４２ＰＤ１細(xì)胞有較強(qiáng)的結(jié)合能力，而克�。茫龋罚稿义虾停茫龋常杜c細(xì)胞膜表面Ａ４２ＰＤ１的結(jié)合能力較弱。因此，我們選擇克�。茫龋常春湾义希茫龋保埃睘楹罄m(xù)的研究對(duì)象。逡逑為了后續(xù)研究的需要

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本文編號(hào)：2788605