本文關(guān)鍵詞：FGFR1通過調(diào)控骨細(xì)胞功能影響骨穩(wěn)態(tài)的作用和機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:骨骼是人體最重要的力學(xué)支持器官,除對機(jī)體起支撐和保護(hù)作用外,骨骼在人體的代謝、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及造血中發(fā)揮重要的作用。骨骼是機(jī)體礦物質(zhì)代謝的重要參與者,通過控制鈣磷等無機(jī)物的儲存和釋放,可調(diào)節(jié)人體礦物質(zhì)的平衡。骨骼還能作為內(nèi)分泌器官釋放多種因子,如骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、成纖維細(xì)胞因子23(Fibroblast growth factor 23,FGF23)等,參與人體能量代謝、血糖、血磷平衡等重要生理過程。骨細(xì)胞是骨自身穩(wěn)態(tài)維持及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素,它能通過多種途徑維持其附近內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,還能對力學(xué)信號進(jìn)行感知和傳導(dǎo),并調(diào)控其周圍骨基質(zhì)礦化。還可通過其樹突與骨表面的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞建立聯(lián)系,調(diào)節(jié)其分化,影響骨重建。此外,骨細(xì)胞還具有內(nèi)分泌功能,調(diào)節(jié)礦物質(zhì)代謝。FGFR1(Fibroblast growth factor receptor 1,成纖維細(xì)胞生長因子I型受體)是FGFRs家族的重要成員,在骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要作用。其突變可引起多種骨骼遺傳性疾病。FGFR1在骨膜、間充質(zhì)細(xì)胞和各階段成骨細(xì)胞中表達(dá)。FGFR1對成骨細(xì)胞不同時(shí)期作用有差別,在骨骼發(fā)育早期抑制其前體細(xì)胞增殖,促進(jìn)向其分化,晚期抑制其礦化。骨細(xì)胞是成骨細(xì)胞的終末分化狀態(tài),亦可能受FGFR1調(diào)控。有研究表明FGFR1參與調(diào)控骨細(xì)胞功能。Wnt/β-catenin信號是調(diào)節(jié)骨細(xì)胞功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不僅能改變骨密度、調(diào)節(jié)骨細(xì)胞釋放重要因子,還能調(diào)控其力學(xué)信號傳導(dǎo)、保持細(xì)胞活性。FGF與Wnt信號間存在相互影響與串話。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)FGFR2和FGFR3均可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin報(bào)道基因活性。因此,我們推測FGFR1也能通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控骨細(xì)胞功能。研究目的:明確FGFR1對骨細(xì)胞的調(diào)控作用。從全新的角度認(rèn)識FGFRs調(diào)控骨代謝及機(jī)體穩(wěn)態(tài)的機(jī)制,也為從干預(yù)FGF/FGFR信號角度調(diào)控機(jī)體穩(wěn)態(tài)提供新的思路。方法:1.獲取、繁殖和鑒定FGFR1在骨細(xì)胞特異敲除的小鼠(Fgfr1DMP1-CKO,突變小鼠);2.骨細(xì)胞特異敲除FGFR1對骨發(fā)育的影響;2.1對胚胎15.5天胎鼠全骨架茜素紅/阿爾辛藍(lán)染色,對比野生和突變小鼠在胚胎期的骨發(fā)育情況;2.22月齡和6月齡小鼠身長、體重測量,比較其發(fā)育有無差異;2.3x線掃描對比觀察兩組小鼠體型和骨量;2.4microct掃描野生型和突變型小鼠股骨,對比觀察骨小梁及骨皮質(zhì)變化;2.5對小鼠脛骨切片vonkossa染色后觀察骨骼礦化情況,并進(jìn)行骨骼形態(tài)學(xué)計(jì)量;3.骨細(xì)胞特異敲除fgfr1對機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響;3.1檢測兩組小鼠2月和6月時(shí)血糖及血清鈣磷水平;4.骨細(xì)胞特異敲除fgfr1對骨重建的影響;4.1對2月齡和6月齡小鼠骨組織切片、染色,觀察其形態(tài);4.2鈣黃綠素雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)對比觀察兩組小鼠骨形成速率;4.3甲苯胺藍(lán)染色形態(tài)計(jì)量單位骨表面成骨細(xì)胞;4.4通過trap染色觀察骨小梁表面的破骨細(xì)胞,并計(jì)量單位骨表面上的數(shù)量及相對表面積;5.骨細(xì)胞特異敲除fgfr1對骨細(xì)胞形態(tài)和功能的影響;5.1he染色觀察骨細(xì)胞和骨陷窩形態(tài);5.2掃描電鏡觀察骨細(xì)胞及骨陷窩形態(tài)變化;5.3提取股骨干總rna,對比兩組間相關(guān)基因表達(dá)變化;5.4分離培養(yǎng)原代骨細(xì)胞,觀察fgfr1敲除的骨細(xì)胞形態(tài)是否有變化;5.5提取原代骨細(xì)胞rna,對比觀察相關(guān)基因表達(dá)變化;6.骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)實(shí)驗(yàn);6.1計(jì)數(shù)6月齡小鼠骨皮質(zhì)骨細(xì)胞空陷窩比例;6.2透射電鏡觀察6月齡骨皮質(zhì)骨細(xì)胞;6.3tunel法檢測6月齡骨細(xì)胞凋亡情況;6.4提取股骨干總rna,檢測凋亡相關(guān)基因表達(dá);結(jié)果:1.骨細(xì)胞中特異敲除fgfr1不影響胚胎期骨發(fā)育;胚胎15.5天胎鼠全骨架染色發(fā)現(xiàn),兩組胎鼠體型無明顯差異,骨骼發(fā)育亦無顯著差別;2.骨細(xì)胞特異敲除fgfr1對成年小鼠發(fā)育無顯著影響,骨量增多;2.1對2月齡和6月齡小鼠進(jìn)行對比觀察,發(fā)現(xiàn)野生小鼠和突變小鼠在這兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)的身長、體重均無明顯差異;2.2x線掃描對比觀察兩組小鼠,發(fā)現(xiàn)體型無明顯差別。突變小鼠骨量較野生小鼠增加;2.3microct掃描發(fā)現(xiàn),突變小鼠bv/tv、conn-dens、tb.n和tb.th均顯著增高,smi和tb.sp則明顯減低。;2.4脛骨切片vonkossa染色形態(tài)學(xué)計(jì)量結(jié)果與上述一致,均提示突變小鼠骨量增加;3.骨細(xì)胞特異敲除fgfr1后,成年的野生和突變小鼠血糖及鈣磷無顯著變化;3.1骨細(xì)胞特異敲除fgfr1后,2月齡和6月齡突變小鼠血糖均有降低趨勢,但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3.2骨細(xì)胞特異敲除fgfr1后,野生小鼠和突變小鼠的血清鈣磷水平在2月和6月時(shí)相點(diǎn)均無顯著差異;4.骨細(xì)胞特異敲除fgfr1后,骨量增多,骨形成增快;4.1組織切片vonkossa染色觀察發(fā)現(xiàn)突變小鼠骨小梁數(shù)量明顯增加,形態(tài)無顯著異常,未見明顯礦化障礙;4.2骨組織切片雙標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn),突變組小鼠骨形成速率、礦化沉積率以及礦化表面積均顯著增加;4.3骨組織切片甲苯胺藍(lán)染色形態(tài)學(xué)計(jì)量發(fā)現(xiàn),突變小鼠單位骨表面成骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加;4.4骨組織切片trap染色形態(tài)學(xué)計(jì)量發(fā)現(xiàn),突變小鼠單位骨表面破骨細(xì)胞數(shù)量及破骨細(xì)胞相對面積均顯著減少;5.骨細(xì)胞特異敲除fgfr1影響骨細(xì)胞形態(tài)和功能,骨陷窩形態(tài)亦發(fā)生變化;5.1he染色切片發(fā)現(xiàn)6月齡突變小鼠骨皮質(zhì)大量空陷窩;5.2掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)6月齡突變小鼠大量骨細(xì)胞形態(tài)趨于橢圓或圓形;骨細(xì)胞陷窩形態(tài)隨之改變,并且有皺縮;5.3提取股骨干組織總rna,檢測相關(guān)基因表達(dá),結(jié)果顯示突變組骨細(xì)胞標(biāo)志性基因fgf23、sost、dmp1表達(dá)均明顯減少。與wnt信號相關(guān)的β-catenin、lef-1、dvl表達(dá)顯著增高,axin2表達(dá)明顯減少。opg/rankl比例與破骨細(xì)胞分化和功能密切相關(guān),我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)前者表達(dá)明顯增高,后者表達(dá)明顯減少,opg/rankl比例上調(diào)。5.4分離兩組小鼠原代骨細(xì)胞,培養(yǎng)觀察未見其形態(tài)有顯著差異。5.5突變小鼠原代骨細(xì)胞標(biāo)志性基因fgf23、sost表達(dá)明顯減少,dmp1表達(dá)明顯增加。與wnt信號相關(guān)的β-catenin、dvl表達(dá)明顯增高,lef-1表達(dá)有增高趨勢,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與破骨細(xì)胞分化和功能相關(guān)的OPG表達(dá)明顯增高,RANKL表達(dá)明顯減少。6.骨細(xì)胞特異敲除FGFR1引起骨細(xì)胞凋亡。6.1 6月齡脛骨石蠟切片HE染色見突變小鼠骨皮質(zhì)空骨陷窩明顯增多。6.2透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)6月齡突變小鼠存在大量凋亡特征骨細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、核凝集、凋亡小體。6.3 TUNEL免疫熒光染色法顯示突變小鼠骨陷窩中凋亡陽性信號明顯增加。6.4突變型骨細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的基因Caspase3和Caspase8表達(dá)顯著升高。結(jié)論:1.骨細(xì)胞缺失FGFR1對胚胎期小鼠無顯著影響。2.骨細(xì)胞特異敲除FGFR1引起FGF23表達(dá)減少,并未影響血清鈣磷水平。3.骨細(xì)胞特異敲除FGFR1使成年期突變小鼠骨量增加,骨形成增快。4.骨細(xì)胞特異敲除FGFR1促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,抑制破骨細(xì)胞分化和功能。5.骨細(xì)胞特異敲除FGFR1后SOST表達(dá)減少,上調(diào)WNT信號通路,引起骨量增加;此外,OPG/RANKL比例上調(diào),負(fù)性調(diào)控破骨細(xì)胞分化和功能,抑制了骨骼重吸收,從而增加骨量。6.骨細(xì)胞特異敲除FGFR1會引起骨細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：FGFR1 骨細(xì)胞 基因敲除 發(fā)育 骨穩(wěn)態(tài)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R336
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-18
• 1.1 骨細(xì)胞可調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)14-15
• 1.2 FGFR1 可能影響骨細(xì)胞功能15-16
• 1.3 Wnt/β-catenin信號可能參與FGFR1 對骨細(xì)胞的調(diào)控16-18
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法18-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-33
• 第三章 結(jié)果33-52
• 3.1 Fgfr1DMP1-CKO小鼠的準(zhǔn)備33-35
• 3.2 骨細(xì)胞特異敲除FGFR1 影響小鼠成年期骨量35-41
• 3.3 在骨細(xì)胞特異敲除FGFR1 后,單位骨小梁表面的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量顯著變化。41-43
• 3.4 骨細(xì)胞特異敲除FGFR1 后骨小梁骨形成速度增快。43-44
• 3.5 骨細(xì)胞敲除FGFR1 后影響骨細(xì)胞功能,可能與WNT信號有關(guān)。44-45
• 3.6 FGFR1 敲除后不影響體外培養(yǎng)的骨細(xì)胞形態(tài),但對其功能有明顯影響。45-49
• 3.7 骨細(xì)胞特異敲除FGFR1 引起骨細(xì)胞凋亡49-52
• 第四章 討論52-56
• 4.1 骨細(xì)胞中特異敲除FGFR1 不影響血糖及鈣磷水平53
• 4.2 骨細(xì)胞特異敲除FGFR1 后未影響胚胎期骨發(fā)育,成年期骨量增多53
• 4.3 骨細(xì)胞特異敲除FGFR1 后骨形成加快,無明顯礦化障礙53-54
• 4.4 骨細(xì)胞敲除FGFR1 影響其形態(tài)和功能54
• 4.5 骨細(xì)胞敲除FGFR1 后通過上調(diào)WNT信號增強(qiáng)成骨作用,通過OPG- RANKL通路抑制破骨細(xì)胞分化與功能54-55
• 4.6 骨細(xì)胞缺失FGFR1 引起骨細(xì)胞凋亡55-56
• 全文結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 文獻(xiàn)綜述 成纖維細(xì)胞生長因子I型受體在骨發(fā)育和骨穩(wěn)態(tài)中的作用61-68
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文68-69
• 致謝69

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本文編號：278698