本文關鍵詞：FGFR1通過調(diào)控骨細胞功能影響骨穩(wěn)態(tài)的作用和機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:骨骼是人體最重要的力學支持器官,除對機體起支撐和保護作用外,骨骼在人體的代謝、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及造血中發(fā)揮重要的作用。骨骼是機體礦物質(zhì)代謝的重要參與者,通過控制鈣磷等無機物的儲存和釋放,可調(diào)節(jié)人體礦物質(zhì)的平衡。骨骼還能作為內(nèi)分泌器官釋放多種因子,如骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、成纖維細胞因子23(Fibroblast growth factor 23,FGF23)等,參與人體能量代謝、血糖、血磷平衡等重要生理過程。骨細胞是骨自身穩(wěn)態(tài)維持及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素,它能通過多種途徑維持其附近內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,還能對力學信號進行感知和傳導,并調(diào)控其周圍骨基質(zhì)礦化。還可通過其樹突與骨表面的成骨細胞和破骨細胞建立聯(lián)系,調(diào)節(jié)其分化,影響骨重建。此外,骨細胞還具有內(nèi)分泌功能,調(diào)節(jié)礦物質(zhì)代謝。FGFR1(Fibroblast growth factor receptor 1,成纖維細胞生長因子I型受體)是FGFRs家族的重要成員,在骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要作用。其突變可引起多種骨骼遺傳性疾病。FGFR1在骨膜、間充質(zhì)細胞和各階段成骨細胞中表達。FGFR1對成骨細胞不同時期作用有差別,在骨骼發(fā)育早期抑制其前體細胞增殖,促進向其分化,晚期抑制其礦化。骨細胞是成骨細胞的終末分化狀態(tài),亦可能受FGFR1調(diào)控。有研究表明FGFR1參與調(diào)控骨細胞功能。Wnt/β-catenin信號是調(diào)節(jié)骨細胞功能的關鍵環(huán)節(jié)。不僅能改變骨密度、調(diào)節(jié)骨細胞釋放重要因子,還能調(diào)控其力學信號傳導、保持細胞活性。FGF與Wnt信號間存在相互影響與串話。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)FGFR2和FGFR3均可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin報道基因活性。因此,我們推測FGFR1也能通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控骨細胞功能。研究目的:明確FGFR1對骨細胞的調(diào)控作用。從全新的角度認識FGFRs調(diào)控骨代謝及機體穩(wěn)態(tài)的機制,也為從干預FGF/FGFR信號角度調(diào)控機體穩(wěn)態(tài)提供新的思路。方法:1.獲取、繁殖和鑒定FGFR1在骨細胞特異敲除的小鼠(Fgfr1DMP1-CKO,突變小鼠);2.骨細胞特異敲除FGFR1對骨發(fā)育的影響;2.1對胚胎15.5天胎鼠全骨架茜素紅/阿爾辛藍染色,對比野生和突變小鼠在胚胎期的骨發(fā)育情況;2.22月齡和6月齡小鼠身長、體重測量,比較其發(fā)育有無差異;2.3x線掃描對比觀察兩組小鼠體型和骨量;2.4microct掃描野生型和突變型小鼠股骨,對比觀察骨小梁及骨皮質(zhì)變化;2.5對小鼠脛骨切片vonkossa染色后觀察骨骼礦化情況,并進行骨骼形態(tài)學計量;3.骨細胞特異敲除fgfr1對機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響;3.1檢測兩組小鼠2月和6月時血糖及血清鈣磷水平;4.骨細胞特異敲除fgfr1對骨重建的影響;4.1對2月齡和6月齡小鼠骨組織切片、染色,觀察其形態(tài);4.2鈣黃綠素雙標實驗對比觀察兩組小鼠骨形成速率;4.3甲苯胺藍染色形態(tài)計量單位骨表面成骨細胞;4.4通過trap染色觀察骨小梁表面的破骨細胞,并計量單位骨表面上的數(shù)量及相對表面積;5.骨細胞特異敲除fgfr1對骨細胞形態(tài)和功能的影響;5.1he染色觀察骨細胞和骨陷窩形態(tài);5.2掃描電鏡觀察骨細胞及骨陷窩形態(tài)變化;5.3提取股骨干總rna,對比兩組間相關基因表達變化;5.4分離培養(yǎng)原代骨細胞,觀察fgfr1敲除的骨細胞形態(tài)是否有變化;5.5提取原代骨細胞rna,對比觀察相關基因表達變化;6.骨細胞凋亡的相關實驗;6.1計數(shù)6月齡小鼠骨皮質(zhì)骨細胞空陷窩比例;6.2透射電鏡觀察6月齡骨皮質(zhì)骨細胞;6.3tunel法檢測6月齡骨細胞凋亡情況;6.4提取股骨干總rna,檢測凋亡相關基因表達;結(jié)果:1.骨細胞中特異敲除fgfr1不影響胚胎期骨發(fā)育;胚胎15.5天胎鼠全骨架染色發(fā)現(xiàn),兩組胎鼠體型無明顯差異,骨骼發(fā)育亦無顯著差別;2.骨細胞特異敲除fgfr1對成年小鼠發(fā)育無顯著影響,骨量增多;2.1對2月齡和6月齡小鼠進行對比觀察,發(fā)現(xiàn)野生小鼠和突變小鼠在這兩個時相點的身長、體重均無明顯差異;2.2x線掃描對比觀察兩組小鼠,發(fā)現(xiàn)體型無明顯差別。突變小鼠骨量較野生小鼠增加;2.3microct掃描發(fā)現(xiàn),突變小鼠bv/tv、conn-dens、tb.n和tb.th均顯著增高,smi和tb.sp則明顯減低。;2.4脛骨切片vonkossa染色形態(tài)學計量結(jié)果與上述一致,均提示突變小鼠骨量增加;3.骨細胞特異敲除fgfr1后,成年的野生和突變小鼠血糖及鈣磷無顯著變化;3.1骨細胞特異敲除fgfr1后,2月齡和6月齡突變小鼠血糖均有降低趨勢,但兩組間差異無統(tǒng)計學意義;3.2骨細胞特異敲除fgfr1后,野生小鼠和突變小鼠的血清鈣磷水平在2月和6月時相點均無顯著差異;4.骨細胞特異敲除fgfr1后,骨量增多,骨形成增快;4.1組織切片vonkossa染色觀察發(fā)現(xiàn)突變小鼠骨小梁數(shù)量明顯增加,形態(tài)無顯著異常,未見明顯礦化障礙;4.2骨組織切片雙標檢測發(fā)現(xiàn),突變組小鼠骨形成速率、礦化沉積率以及礦化表面積均顯著增加;4.3骨組織切片甲苯胺藍染色形態(tài)學計量發(fā)現(xiàn),突變小鼠單位骨表面成骨細胞數(shù)量顯著增加;4.4骨組織切片trap染色形態(tài)學計量發(fā)現(xiàn),突變小鼠單位骨表面破骨細胞數(shù)量及破骨細胞相對面積均顯著減少;5.骨細胞特異敲除fgfr1影響骨細胞形態(tài)和功能,骨陷窩形態(tài)亦發(fā)生變化;5.1he染色切片發(fā)現(xiàn)6月齡突變小鼠骨皮質(zhì)大量空陷窩;5.2掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)6月齡突變小鼠大量骨細胞形態(tài)趨于橢圓或圓形;骨細胞陷窩形態(tài)隨之改變,并且有皺縮;5.3提取股骨干組織總rna,檢測相關基因表達,結(jié)果顯示突變組骨細胞標志性基因fgf23、sost、dmp1表達均明顯減少。與wnt信號相關的β-catenin、lef-1、dvl表達顯著增高,axin2表達明顯減少。opg/rankl比例與破骨細胞分化和功能密切相關,我們在實驗中發(fā)現(xiàn)前者表達明顯增高,后者表達明顯減少,opg/rankl比例上調(diào)。5.4分離兩組小鼠原代骨細胞,培養(yǎng)觀察未見其形態(tài)有顯著差異。5.5突變小鼠原代骨細胞標志性基因fgf23、sost表達明顯減少,dmp1表達明顯增加。與wnt信號相關的β-catenin、dvl表達明顯增高,lef-1表達有增高趨勢,無統(tǒng)計學差異。與破骨細胞分化和功能相關的OPG表達明顯增高,RANKL表達明顯減少。6.骨細胞特異敲除FGFR1引起骨細胞凋亡。6.1 6月齡脛骨石蠟切片HE染色見突變小鼠骨皮質(zhì)空骨陷窩明顯增多。6.2透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)6月齡突變小鼠存在大量凋亡特征骨細胞,表現(xiàn)為細胞皺縮、核凝集、凋亡小體。6.3 TUNEL免疫熒光染色法顯示突變小鼠骨陷窩中凋亡陽性信號明顯增加。6.4突變型骨細胞中與凋亡相關的基因Caspase3和Caspase8表達顯著升高。結(jié)論:1.骨細胞缺失FGFR1對胚胎期小鼠無顯著影響。2.骨細胞特異敲除FGFR1引起FGF23表達減少,并未影響血清鈣磷水平。3.骨細胞特異敲除FGFR1使成年期突變小鼠骨量增加,骨形成增快。4.骨細胞特異敲除FGFR1促進成骨細胞分化,抑制破骨細胞分化和功能。5.骨細胞特異敲除FGFR1后SOST表達減少,上調(diào)WNT信號通路,引起骨量增加;此外,OPG/RANKL比例上調(diào),負性調(diào)控破骨細胞分化和功能,抑制了骨骼重吸收,從而增加骨量。6.骨細胞特異敲除FGFR1會引起骨細胞凋亡。
【關鍵詞】：FGFR1 骨細胞 基因敲除 發(fā)育 骨穩(wěn)態(tài)
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R336
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-18
• 1.1 骨細胞可調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)14-15
• 1.2 FGFR1 可能影響骨細胞功能15-16
• 1.3 Wnt/β-catenin信號可能參與FGFR1 對骨細胞的調(diào)控16-18
• 第二章 實驗材料和方法18-33
• 2.1 實驗材料18-21
• 2.2 實驗方法21-33
• 第三章 結(jié)果33-52
• 3.1 Fgfr1DMP1-CKO小鼠的準備33-35
• 3.2 骨細胞特異敲除FGFR1 影響小鼠成年期骨量35-41
• 3.3 在骨細胞特異敲除FGFR1 后,單位骨小梁表面的成骨細胞和破骨細胞數(shù)量顯著變化。41-43
• 3.4 骨細胞特異敲除FGFR1 后骨小梁骨形成速度增快。43-44
• 3.5 骨細胞敲除FGFR1 后影響骨細胞功能,可能與WNT信號有關。44-45
• 3.6 FGFR1 敲除后不影響體外培養(yǎng)的骨細胞形態(tài),但對其功能有明顯影響。45-49
• 3.7 骨細胞特異敲除FGFR1 引起骨細胞凋亡49-52
• 第四章 討論52-56
• 4.1 骨細胞中特異敲除FGFR1 不影響血糖及鈣磷水平53
• 4.2 骨細胞特異敲除FGFR1 后未影響胚胎期骨發(fā)育,成年期骨量增多53
• 4.3 骨細胞特異敲除FGFR1 后骨形成加快,無明顯礦化障礙53-54
• 4.4 骨細胞敲除FGFR1 影響其形態(tài)和功能54
• 4.5 骨細胞敲除FGFR1 后通過上調(diào)WNT信號增強成骨作用,通過OPG- RANKL通路抑制破骨細胞分化與功能54-55
• 4.6 骨細胞缺失FGFR1 引起骨細胞凋亡55-56
• 全文結(jié)論56-57
• 參考文獻57-61
• 文獻綜述 成纖維細胞生長因子I型受體在骨發(fā)育和骨穩(wěn)態(tài)中的作用61-68
• 參考文獻65-68
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文68-69
• 致謝69

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  本文關鍵詞：FGFR1通過調(diào)控骨細胞功能影響骨穩(wěn)態(tài)的作用和機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：278698