發(fā)布時(shí)間：2020-08-07 03:23

【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的一種嚴(yán)重危害公共健康具有高傳染性和高死亡率的慢性傳染病。近年來出現(xiàn)了越來越多的廣泛耐藥的結(jié)核菌(XDR)、耐多藥的結(jié)核菌(MDR)、全耐藥的結(jié)核菌(TDR),使得結(jié)核病的防治和治療更加的困難,于是我們急需探索治療結(jié)核病的新方法,尋找新的治療結(jié)核病的抗生素藥物。最早研究人員是在質(zhì)粒的穩(wěn)定系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)毒素抗毒素系統(tǒng)的。在環(huán)境壓力條件下,由于基因表達(dá)的抑制和蛋白酶的降解作用,不穩(wěn)定的抗毒素減少,從而產(chǎn)生游離的穩(wěn)定的毒素蛋白,導(dǎo)致細(xì)菌的生長抑制或者死亡。在結(jié)核分枝桿菌H37Rv中研究共確定了79對毒素抗毒素系統(tǒng),VapBC毒素抗毒素系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌中數(shù)量最多。毒素蛋白VapC具有核糖核酸酶共有的PIN區(qū)域(與PilT N-terminal區(qū)域同源),VapB是結(jié)構(gòu)域的抑制劑。VapBC毒素抗毒素系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌中的作用很大程度上是未知的,對結(jié)核病研究具有重大的意義。先前研究報(bào)道結(jié)核分枝桿菌Rv2872具有PIN結(jié)構(gòu)域,是預(yù)測的VapC家族的毒素,在多種抗生素環(huán)境下上調(diào)表達(dá),Rv2872可能與結(jié)核分枝桿菌持留和耐藥相關(guān)并且可能具有RNA酶活性。為了探究Rv2872在結(jié)核分枝桿菌中的作用,我們構(gòu)建了重組恥垢分枝桿菌(MS_Rv2872)和空載菌(MS_Vec)。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Rv2872能夠抑制恥垢分枝桿菌的生長。這與我們之前發(fā)現(xiàn)的毒素作用是一致的。已有研究發(fā)現(xiàn)用不同濃度的萬古霉素處理結(jié)核分枝桿菌后多個(gè)毒素基因上調(diào)表達(dá),我們的研究結(jié)果證明MS_Rv2872對萬古霉素耐受,這說明Rv2872可能通過某些途徑調(diào)控某些耐藥基因的表達(dá)從而對萬古霉素具有耐受性。先前研究報(bào)道萬古霉素處理結(jié)核分枝桿菌后差異表達(dá)的基因包括100多個(gè),我們通過熒光定量PCR檢測了其中在恥垢分枝桿菌中具有同源基因的幾個(gè)基因在重組菌MS_Rv2872和MS_Vec中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)Rv2872表達(dá)導(dǎo)致MSMEG_Rv0051和MSMEG_2694兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),MSMEG_0424,MSMEG_1764,MSMEG_4979三個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。之前研究發(fā)現(xiàn)MSMEG_0424,MSMEG_1764,MSMEG_4979三個(gè)基因在萬古霉素處理?xiàng)l件下表現(xiàn)出不同程度的敏感。為了進(jìn)一步探究MSMEG_Rv0051和MSMEG_2694這兩個(gè)基因是否與萬古霉素敏感相關(guān),我們構(gòu)建了這兩個(gè)基因在恥垢分枝桿菌中的的過表達(dá)菌株,用萬古霉素處理這些重組菌后,發(fā)現(xiàn)這些過表達(dá)菌株均對萬古霉素有不同程度的耐受。同時(shí)我們研究發(fā)現(xiàn)MSMEG_2916是萬古霉素耐受基因MSMEG_0051的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,MSMEG_2916可負(fù)調(diào)控MSMEG_0051。純化的Rv2872毒素蛋白可以直接剪切MSMEG_2916的RNA,從而下調(diào)MSMEG_2916的轉(zhuǎn)錄水平,從而上調(diào)MSMEG_0051的轉(zhuǎn)錄水平,導(dǎo)致萬古霉素耐受。Rv2872在重組恥垢分枝桿菌中也引起其他顯著的表型改變,如改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、改變體內(nèi)氨基酸的含量和細(xì)菌生物膜的組成等。同時(shí)生物膜形成相關(guān)基因MSMEG_6092的RNA也能直接被Rv2872蛋白剪切,引起MSMEG_6092轉(zhuǎn)錄水平的下降,導(dǎo)致MS_Rv2872的生物膜改變。研究發(fā)現(xiàn),Rv2872表型的改變,都可能是由于Rv2872的特異核糖核酸酶活性導(dǎo)致相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。Rv2782在細(xì)菌生理、遺傳學(xué)和發(fā)病機(jī)制中,作為重要的因子,這種作用與已證明的毒素抗毒素系統(tǒng)的作用功能是一致的。同時(shí)我們的研究也第一次報(bào)道毒素Rv2872為一種特定序列的核糖核酸酶,涉及抗生素的應(yīng)激反應(yīng)和生物膜的形成。針對Rv2872毒素的抑制劑可能是萬古霉素和其他針對細(xì)胞壁生物合成的抗生素的理想潛在藥物。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R378.911
【圖文】：

所有細(xì)菌毒素抗毒素系統(tǒng)中，抗毒素是蛋白質(zhì)或小RNA(sRNAs)，而毒素總是蛋白質(zhì)。根據(jù)相互作用的不同毒素抗毒素系統(tǒng)，分為6種類型（圖1.1）[7]。Ⅰ型和Ⅲ型毒素抗毒素系統(tǒng)中抗毒素都是RNA，而其他幾種類型中抗毒素都是蛋白質(zhì)[8]。圖1.1 毒素抗毒素系統(tǒng)分類Figure 1.1 Toxin Antitoxin Systems Classification

是我們從GEO中下載并分析了多種抗生素處理下結(jié)核分枝桿菌基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GSE1642)[61]。研究發(fā)現(xiàn)，在20種不同抗生素處理下，76個(gè)毒素基因在轉(zhuǎn)錄水平上差異表達(dá)。如圖4.1所示，在多種抗生素處理下，多個(gè)毒素基因在轉(zhuǎn)錄水平上上圖 4.1毒素抗毒素基因暴露在不同抗生素下的轉(zhuǎn)錄組分析。Figure 4.1 The transcriptional response of M. tuberculosis toxin genes to antibiotics exposure. Eachcolumn is the average of several microarray experiments using the same drug treatment, each box within a row is theaverage for all genes assigned to the same gene cluster. The inset shows a color scale for z-scores.

圖 4.2 VapC家族蛋白在結(jié)核菌中不保守。Fig4.2 VapC family proteins in M. tuberculosis is not conservative.Sequence obtained from NCBI searchand aligned using ESPript (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi).4.3 成功構(gòu)建表達(dá) Rv2872 基因的重組恥垢分枝桿菌我們以結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組DNA為模板，以F1、R1為特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)果用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。已知，Rv2872目的基因的大小為444bp，如圖所示，在250-500 bp之間有一條明顯的與目的片段大小一致的條帶（圖4.3A）。其中DNAMarker為DL2000。通過BamH I和Cla I限制性內(nèi)切酶對Rv2872和pALACE質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（體系如表5），膠回收酶切產(chǎn)物，再利用DNA連接酶將其連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α細(xì)胞中，然后通過菌液PCR再次驗(yàn)證Rv2872基因與pALACE質(zhì)粒成功連接。提取重組質(zhì)粒送華大公司測序，DNAMAN比對測序結(jié)果顯示重組質(zhì)

【相似文獻(xiàn)】

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1 王小雨;結(jié)核分枝桿菌毒素Rv2872促進(jìn)重組菌耐受萬古霉素和影響生物膜形成的分子機(jī)理[D];西南大學(xué);2018年

本文編號：2783399