【摘要】：第一部分結(jié)核亞單位疫苗免疫方案和IL-7、IL-15對(duì)T細(xì)胞免疫記憶的影響結(jié)核病(tuberculosis)是主要由結(jié)核分枝桿菌感染(Mycobacterzum tuberculosis)引起的一種慢性傳染性疾病。其病死率在傳染性疾病中已經(jīng)居于第一位,是全世界的第九大死因。預(yù)防和控制傳染病的最佳方式就是有效疫苗的接種,結(jié)核病難于控制的主要原因是缺乏有效的結(jié)核病疫苗。目前唯一臨床批準(zhǔn)的預(yù)防結(jié)核病的疫苗是牛分枝桿菌減毒活_活疫苗卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)。它能夠有效地控制兒童嚴(yán)重結(jié)核病的發(fā)生,但是,它的保護(hù)性免疫應(yīng)答隨著年齡的增加逐漸減弱,對(duì)成人肺結(jié)核保護(hù)效果不確定。研究報(bào)道,主要是因?yàn)锽CG的持續(xù)刺激,誘導(dǎo)更多的壽命較短的效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(effector memory T cells,TEM)和效應(yīng)T細(xì)胞(effector T cells,Teff)產(chǎn)生,而提供長(zhǎng)效免疫保護(hù)效果的中央記憶性T細(xì)胞(central memory T cells,TcM)較少所致。因此,研發(fā)新的結(jié)核疫苗和有效的免疫策略來(lái)提高TCM的數(shù)量,增強(qiáng)長(zhǎng)效的保護(hù)效果是目前的當(dāng)務(wù)之急。蛋白亞單位疫苗是一種新型的結(jié)核疫苗,可以誘導(dǎo)足夠多的TCM提供抗結(jié)核的長(zhǎng)期保護(hù)效果。亞單位疫苗通常需要多次加強(qiáng)免疫才能取得有效的免疫保護(hù)。研究認(rèn)為加強(qiáng)的時(shí)間間隔可以決定T細(xì)胞的類(lèi)型,影響機(jī)體抗感染的免疫記憶應(yīng)答。因此優(yōu)化亞單位疫苗免疫接種間隔對(duì)于誘導(dǎo)長(zhǎng)效的免疫記憶具有重要意義。結(jié)核亞單位疫苗常規(guī)免疫方案是免疫3次,每次間隔2-3周。目前尚缺乏對(duì)結(jié)核亞單位疫苗免疫接種方案對(duì)T細(xì)胞免疫記憶的系統(tǒng)研究。同時(shí),亞單位疫苗需要佐劑的輔助來(lái)誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答,合適的佐劑能提高免疫應(yīng)答的水平。目前臨床上使用的佐劑很少,它們主要促進(jìn)體液免疫應(yīng)答。因此,研發(fā)可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的佐劑對(duì)于結(jié)核疫苗的開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。一些研究表明:IL-7和IL-15對(duì)于記憶T細(xì)胞的發(fā)育和維持至關(guān)重要。因此本研究我們選用了實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的結(jié)核亞單位疫苗 ESAT6-Ag85B-MPT64190(198-Mtb8.4-Rv2626c(簡(jiǎn)稱(chēng) LT70)和Mtb10.4-HspX(簡(jiǎn)稱(chēng)MH),它們?cè)谛∈髮?shí)驗(yàn)中均展現(xiàn)出了較強(qiáng)的免疫保護(hù)效果。我們應(yīng)用LT70和MH,研究結(jié)核亞單位疫苗免疫方案和IL-7、IL-15對(duì)T細(xì)胞免疫記憶的影響。目的:基于上述研究背景,本研究應(yīng)用結(jié)核亞單位疫苗進(jìn)行下列研究:1、通過(guò)設(shè)計(jì)結(jié)核亞單位疫苗不同的免疫間隔時(shí)間,研究疫苗免疫間隔時(shí)間對(duì)T細(xì)胞免疫記憶的影響。2、此外,應(yīng)用細(xì)胞因子IL-7和IL-15作為結(jié)核亞單位疫苗的佐劑,以提高結(jié)核亞單位疫苗誘導(dǎo)的免疫記憶和更持久的保護(hù)效果。方法:1、制備亞單位疫苗LT70,按照下列方案免疫小鼠:①0、3周和6周(0-3-6w),②0、4 周和 12 周(0-4-12w)和③0、4 周和 24 周(0-4-24w);PBS和BCG(5×105CFU)組作為對(duì)照組。各個(gè)免疫組末次免疫時(shí)間一致。2、應(yīng)用腺病毒包裝系統(tǒng)AdMax構(gòu)建和包裝重組腺病毒rAd-IL-7、rAd-IL-15、rAd-IL-7-IL-15 和 rAd-IL-7-IL-15(Linker);選用結(jié)核亞單位疫苗 LT70 和 MH 聯(lián)合重組腺病毒 rAd-IL-7、rAd-IL-15、rAd-IL-7-IL-15 和 rAd-IL-7-IL-15(Linker),分別在第0、2、4周免疫小鼠。3、通過(guò)ELISA法檢測(cè)Ag85B特異性抗體IgG1的水平;通過(guò)ELISA法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的水平；通過(guò)胞內(nèi)染色法檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平;通過(guò)延長(zhǎng)ELISPOT檢測(cè)中央記憶樣T細(xì)胞的數(shù)量;利用兩次抗原刺激,胞內(nèi)染色法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力,反映CD4+和CD8+中央記憶樣T細(xì)胞的數(shù)量；通過(guò)EdU法檢測(cè)CD4+和CD8+記憶T細(xì)胞的增殖水平;通過(guò)TB10.4 pentamer檢測(cè)TB10.4特異性的CD8+記憶性T細(xì)胞的數(shù)量;通過(guò)BCG滴鼻攻擊檢測(cè)保護(hù)效果的差異。結(jié)果：1、0-3-6w 組(1.84±0.42)和 0-4-12w 組(1.42±0.19)兩個(gè)免疫方案誘導(dǎo)的Ag85B特異的IgG1抗體水平較0-4-24w組(0.91±0.29)高(P0.001和P0.05);0-4-12w組和0-4-24w組產(chǎn)生的Ag85B特異的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-aLk0-3-6w組有明顯的升高,其中0-4-12w組的IL-2 7水平最高;延長(zhǎng)ELISPOT、兩次抗原刺激后CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力、記憶T細(xì)胞的增殖水平等結(jié)果表明,與0-3-6w免疫方案相比,0-4-12w的免疫方案明顯提高中央記憶樣T細(xì)胞的數(shù)量和功能,誘導(dǎo)的T細(xì)胞具有較高的增殖能力;用BCG攻擊試驗(yàn)證實(shí)LT70疫苗0-4-12w的免疫方案(5.01±0.14 Log10 CFU)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效率高于傳統(tǒng)的0-3-6w免疫方案(5.42±0.17 Log10 CFU)。2、成功包裝 了重組腺病毒 rAd-IL-7、rAd-IL-15、rAd-IL-7-IL-15、rAd-IL-7-IL-15(Linker)和rAd-vector,并獲得了較高的病毒滴度,分別是8×109 PFU/ml、1× 1010 PFU/ml、9 ×109 PFU/ml、1 ×1010 PFU/ml 和 1× 1010 PFU/ml。小鼠在0、2和4周用結(jié)核亞單位疫苗LT70和MH聯(lián)合IL-7、IL-15、IL-7-IL-15、IL-7-IL-15(Linker)和 IL-7+rAd-IL-15 免疫。末次免疫后 20 周通過(guò)延長(zhǎng) ELISPOT法,兩次抗原刺激后胞內(nèi)染色法檢測(cè)中央記憶樣T細(xì)胞的數(shù)量,通過(guò)EdU法檢測(cè)記憶T細(xì)胞的增殖水平;通過(guò)TB10.4 pentameir檢測(cè)TB10.4特異性的CD8+記憶性T細(xì)胞的數(shù)量,結(jié)果顯示:①相比于對(duì)照組LT70+MH(186.0±30.5SFC/1 X 106 cells)和 LT70+MH+rAd-vector(211.6±22.4 SFC/1×106 cells),LT70+MH+rAd-IL-7 組(299.3±20.9 SFC/1×106 cells)、LT70+MH+rAd-IL-15 組(273.3±25.2 SFC/1×106 cells)、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 組(325.6±19.7 SFC/1×106 cells)、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)組(382.2±32.9 SFC/1×106 cells)和 LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 組(361.4±17.2 SFC/1×106 cells)淋巴細(xì)胞分泌IFN-y的細(xì)胞數(shù)量明顯升高；同時(shí),LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)組分泌 IFN-γ 的細(xì)胞 明 顯高于 LT70+MH+rAd-IL-7 組(P0.001),LT70+MH+rAd-IL-15 組(P0.001)和 LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 組(P0.05)。②LT70+MH+rAd-IL-7 組、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 組、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)和 LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 組脾臟淋巴細(xì)胞在兩次抗原刺激后IFN-γ的分泌水平明顯高于對(duì)照組LT70+MH和LT70+MH+rAd-vector。LT70+MH+rAd-IL-7 組、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)組和LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15組骨髓淋巴細(xì)胞在兩次抗原刺激后IFN-γ的分泌水平也明顯高于對(duì)照組LT70+MH和LT70+MH+rAd-vector。③對(duì)于CD4+T細(xì)胞來(lái)說(shuō),LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)組 EdU+細(xì)胞比例是 1.57%,LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 組為1.13%,LT70+MH+rAd-IL-7 組為 1.05%,這三組與對(duì)照組LT70+MH+rAd-vector(0.27%)相比均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)組 EdU+細(xì)胞比例比 LT70+MH+rAd-IL-15 組和LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 組分別升高 1.05%和 0.670-0(P0.001 和P0.05)。CD8+T細(xì)胞和總淋巴細(xì)胞EdU+細(xì)胞的變化趨勢(shì)與CD4+T細(xì)胞的整體一致。@LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)組 TB10.4 特異性的 CD8+記憶性 T 細(xì)胞比例最高,為 0.6%,其次 LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 組為 0.46%,LT70+MH+rAd-IL-7 組為 0.40%,LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 組為 0.31%,LT70+MH+rAd-IL-15 組為 0.29%,LT70+MH+rAd-vector 為 0.22%,LT70+MH 組為0.15%。末次免疫后24周檢測(cè)BCG感染后的菌載量:⑤在肺臟,與對(duì)照組LT70+MH 和 LT70+MH+rAd-vector 相比,LT70+MH+rAd-IL-7 組、LT70+MH+rAd-IL-15 組 和 LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 組LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)和 LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 組菌載量都有明顯的降低；同時(shí),LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)組保護(hù)效果最好,與LT70+MH+rAd-IL-7 組和 LT70+MH+rAd-IL-15 組相比,菌載量分別降低了 0.38 Log10 CFU 和 0.50 Log10 CFU。在脾臟 LT70+MH+rAd-IL-7 組(4.73±0.95 Log10 CFU)、LT70+MH+rAd-IL-15 組(4.74±0.14Log10 CFU)和LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 組(4.75±0.12Log10 CFU)、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)(4.58±0.12Log10 CFU)和LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 組(4.66±0.12Log10 CFU)菌載量比對(duì)照組LT70+MH(5.04±0.17 Log10 CFU)和 LT70+MH+rAd-vector(5.02±0.15 Log10 CFU)都有明顯的降低。結(jié)論:1、結(jié)核亞單位疫苗免疫方案0-4-12w誘導(dǎo)產(chǎn)生了更多的中央記憶樣T細(xì)胞,免疫保護(hù)水平也相應(yīng)增強(qiáng)。研究結(jié)果表明延長(zhǎng)結(jié)核亞單位疫苗的接種間隔在一定程度上有助于誘導(dǎo)更多的中央記憶樣T細(xì)胞形成以及更好的保護(hù)效果。2、IL-7、IL-7-IL-15(Linker)和IL-7+IL-15與亞單位疫苗LT70+MH聯(lián)合應(yīng)用,不僅可以提高中央記憶樣T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,而且還增強(qiáng)抗分枝桿菌感染的能力。第二部分IL-7和IL-15對(duì)小鼠U14宮頸癌的免疫治療作用宮頸癌(Cervical Cancer,CC)是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在女性惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率位列第二。據(jù)統(tǒng)計(jì),發(fā)展中國(guó)家仍是宮頸癌發(fā)生的重災(zāi)區(qū),每年有850-%的新發(fā)病例。目前腫瘤臨床主要的治療方法是以手術(shù)、放化療為主。宮頸癌由于較高的死亡率和缺乏有效的治療方法而被廣泛關(guān)注。近年來(lái),許多科學(xué)家越來(lái)越致力于免疫治療和靶向治療來(lái)有效地促進(jìn)腫瘤治療策略的發(fā)展。本研究關(guān)注的是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子IL-7和IL-15對(duì)宮頸癌的免疫治療作用。目的:應(yīng)用重組腺病毒IL-7和IL-15(rAd-IL-7和rAd-IL-15),研究IL-7、IL-15以及IL-7+IL-15對(duì)U14宮頸癌皮下移植瘤小鼠的治療作用及其機(jī)制。方法:1、體外培養(yǎng)小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14,建立C57BL/6J小鼠U14宮頸癌腹水模型和皮下移植瘤模型。2、在U14皮下移植瘤模型基礎(chǔ)上,應(yīng)用重組腺病毒IL-7和IL-15(rAd-IL-7和rAd-IL-15)進(jìn)行干預(yù)治療,觀察并檢測(cè)以下指標(biāo):測(cè)量小鼠U14宮頸癌皮下移植瘤瘤體的大小；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平;通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清中IFN-γ的含量;通過(guò)CCK-8法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞的活力。結(jié)果:1、成功構(gòu)建了 U14宮頸癌皮下移植瘤模型。2、與對(duì)照組rAd-vector和PBS相比,rAd-IL-15治療組明顯下調(diào)CD4+CD25+Foxp3+Treg(P0.05)。3、與對(duì)照組 rAd-vector 和 PBS 相比,治療組rAd-IL-7、rAd-IL-15 和 rAd-IL-7+rAd-IL-15 的瘤體積明顯縮小(P0.05)。4、與對(duì)照組rAd-vector和PBS相比,rAd-IL-15治療組明顯下調(diào)了 CD4+和CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)(P0.05);rAd-IL-15組淋巴細(xì)胞的活力與對(duì)照組rAd-vector和PBS相比,有明顯的升高(P0.001)。結(jié)論:1、rAd-IL-7、rAd-IL-15 以及 rAd-IL-7 和 rAd-IL-15 聯(lián)合應(yīng)用均能抑制小鼠U14宮頸癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)。2、rAd-IL-15能明顯下調(diào)U14宮頸癌皮下移植瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例,降低脾臟CD4+和CD8+ T細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平,同時(shí)也能升高血清中IFN-γ的含量,增強(qiáng)機(jī)體的免疫效應(yīng)。因此IL-15可能是通過(guò)下調(diào)抑制性細(xì)胞和表面抑制性受體的水平,增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答,進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。3、rAd-IL-7則是對(duì)Treg和PD-1的水平無(wú)影響,它發(fā)揮抗腫瘤作用可能是通過(guò)其他機(jī)制,有待于進(jìn)一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【圖文】：

2.2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 means±SD 表示，應(yīng)用 SPSS17.0 軟件和 One-Way ANOVA 分方法。P<0.05 認(rèn)為有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 Ag85B、Rv2626c 和 HspX 蛋白的表達(dá)與純化將已經(jīng)轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌表達(dá)菌株 BL21（DE3）中 pET30a-Ag85pET30a-Rv2626c 和 pET30a-HspX 的菌種活化、增菌，經(jīng)誘導(dǎo)劑 IPTG 誘導(dǎo)后離心收集菌體，超聲破碎后離心收集上清和沉淀。SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示Ag85B、Rv2626c 和 HspX 蛋白上清中在相對(duì)應(yīng)分子量處有比較明顯的特異蛋表達(dá)條帶，如圖 2-1A、2-2A 和 2-3A 所示。Ag85B、Rv2626c 和 HspX 的目的帶分別在 200mM 咪唑洗脫液、150mM 咪唑洗脫液和 200mM 咪唑洗脫液處純效果最佳，見(jiàn)圖 2-1B、2-2B 和 2-3B。

圖 2-2 Rv2626c 的表達(dá)和純化Figure 2-2 Expression and purification of Rv2626cM：marker；1：Rv2626c 破碎后全菌；2：Rv2626c 破碎后上清；3：Rv2626c 破碎后沉4 流穿；5：洗滌液；6：10mM 咪唑洗脫液；7：25mM 咪唑洗脫液；8：50mM 咪唑洗脫9：100mM 咪唑洗脫液；10：150 mM 咪唑洗脫液；11：200 mM 咪唑洗脫液

圖 2-2 Rv2626c 的表達(dá)和純化Figure 2-2 Expression and purification of Rv2626c：marker；1：Rv2626c 破碎后全菌；2：Rv2626c 破碎后上清；3：Rv2626c 破碎后沉淀 流穿；5：洗滌液；6：10mM 咪唑洗脫液；7：25mM 咪唑洗脫液；8：50mM 咪唑洗脫液：100mM 咪唑洗脫液；10：150 mM 咪唑洗脫液；11：200 mM 咪唑洗脫液

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9 徐麗紅;春季防疫正當(dāng)時(shí)[N];中國(guó)財(cái)經(jīng)報(bào);2006年

10 農(nóng)業(yè)部重大動(dòng)物疫病防控定點(diǎn)聯(lián)系赴山西督查組;山西狠抓關(guān)鍵防控措施[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 白春香;結(jié)核亞單位疫苗免疫方案和IL-7、IL-15對(duì)T細(xì)胞免疫記憶的影響[D];蘭州大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 王小三;PRRS不同免疫程序?qū)嵤┴i群抗體水平監(jiān)測(cè)分析[D];河南科技大學(xué);2012年

2 尚璇;H5N1亞型禽流感防疫中應(yīng)用生物信息學(xué)研究免疫方案的探討[D];華中科技大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2782918