【摘要】：背景與目的:手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)是一種全球流行的急性傳染性疾病,表現(xiàn)為囊泡侵襲5歲以下兒童的手部、足底及口周。大部分患者癥狀較輕,可以憑借自身的免疫力自愈,但若不加以重視,容易造成腦膜炎和肺水腫等并發(fā)癥并且危及生命。近年來,手足口病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,其致死率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過我國其它C類傳染疾病。該病嚴(yán)重危害了兒童的生命健康,由此也引起了中國衛(wèi)生部門的高度重視。一直以來,腸道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CVA16)被廣泛地認(rèn)為是手足口病的主要病原體,而近幾年,柯薩奇病毒A組6型(Coxsackievirus A6,CVA6)誘發(fā)的手足口病病例逐漸增多。由于二代測序技術(shù)的發(fā)展,病毒在分子層面的研究不斷深入,計算機(jī)的發(fā)展促使生物信息學(xué)技術(shù)應(yīng)運而生,采用計算機(jī)方法分析生物學(xué)問題已經(jīng)成為當(dāng)下流行趨勢。應(yīng)用貝葉斯方法構(gòu)建的最大可信分支樹與其它方法相比具有更準(zhǔn)確、更高效等特點。它通過限定最合適的核苷酸替代模型使系統(tǒng)發(fā)育樹的模型更加精確,同時計算后驗概率使最終得出的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化�；谪惾~斯方法的種種優(yōu)勢,研究人員已將其用于病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析中。在腸道病毒中,基因重組情況普遍存在,病毒通過遺傳信息的轉(zhuǎn)移適應(yīng)環(huán)境,產(chǎn)生新的基因型,因此基因重組是病毒變異和進(jìn)化的重要原因。當(dāng)下,手足口病的主要病原體EV71的疫苗已應(yīng)用于臨床,CVA16疫苗也在緊張地研發(fā)中,然而,關(guān)于CVA6疫苗的研發(fā)卻鮮少報道。因此,本研究深入了解了CVA6的進(jìn)化趨勢以及遺傳特征,不僅對手足口病預(yù)防和控制具有實用價值,也為疫苗的研發(fā)、藥物靶位的篩選提供理論基礎(chǔ)。材料與方法:本研究共收集了57份長春市2015年手足口病標(biāo)本,通過逆轉(zhuǎn)錄PCR對病毒樣本進(jìn)行分子分型,并對其中11株CVA6 VP1基因進(jìn)行擴(kuò)增并測序,將測序結(jié)果上傳至Genbank。從Genbank中下載353條帶有明確分離時間以及地點的CVA6 VP1基因序列,用MEGA剪掉多余序列,進(jìn)行重組檢測、飽和度檢測以及選擇最適合的核苷酸替代模型。將經(jīng)過預(yù)處理的序列通過貝葉斯方法建立最大可信分支樹(maximum clade credibility tree,MCC),并繪制Bayesian skyline plot,分析CVA6 VP1基因的進(jìn)化特征。從Genbank中下載148條CVA6全基因組序列,經(jīng)過MEGA比對后用RDP4以及Simplot進(jìn)行重組分析,進(jìn)一步探討CVA6的進(jìn)化趨勢及遺傳特征。結(jié)果:本研究從57份手足口病樣本中分離得到11株CVA6,與原始株相比,測序所得的這11株CVA6 VP1基因核苷酸變異率為16.8%-17.6%,氨基酸變異率為3.3%-6.7%。根據(jù)貝葉斯方法構(gòu)建的最大可信分支樹表明1992年至2015年間的CVA6共分為GⅠ-GⅤ五個基因型,GⅣ基因型進(jìn)一步分為GⅣ-1型和GⅣ-2型,GⅤ基因型進(jìn)一步分為GⅤ-1型和GⅤ-2型。本研究分離得到的11株CVA6中有10株為GⅤ-2型,1株為GⅣ-2型。中國近年來流行的CVA6為GⅣ-2型和GⅤ-2型,并且以GⅤ-2型為主。CVA6 VP1基因多態(tài)性曲線在1999年及2006有明顯的上升趨勢,在2002年至2005年以及2011年至2015年期間相對平穩(wěn)。CVA6 VP1基因的進(jìn)化率為平均每年每個位點發(fā)生4.7982E-3次替代事件。CVA6 VP1基因編碼的氨基酸的三位密碼子的突變率分別為0.303、0.105及2.599。對CVA6全基因組進(jìn)行重組分析,CVA6在編碼結(jié)構(gòu)蛋白的VP1、VP2、VP3、VP4區(qū)域中均發(fā)生不同程度的型內(nèi)重組,而在非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū),基因重組集中發(fā)生于2A、2B和3A區(qū)域,并且在22個重組株中,有15株在2B區(qū)域發(fā)生重組(68.18%)。結(jié)論:本研究采用貝葉斯方法,將1992年至2015年間全球CVA6分為GⅠ-GⅤ五個基因型,在2002-2005年以及2011-2015年期間CVA6 VP1基因的遺傳相對穩(wěn)定,并未出現(xiàn)新的基因型。從長春地區(qū)分離的CVA6為GⅣ-2基因亞型(1/11,9.09%)和GⅤ-2基因亞型(10/11,90.90%)。CVA6全基因組的重組分析結(jié)果表明,CVA6的型內(nèi)重組在結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)均可發(fā)生,但在非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)中重組現(xiàn)象更為普遍。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R373
【圖文】：

圖 2.1 正常細(xì)胞與接入 CVA6 的病變細(xì)胞 CPE 對比圖。（A）為正常 RD 細(xì)胞；（B）（C）（D）為 RD 細(xì)胞接入病毒后變圓、聚團(tuán)、全部漂起的病變狀態(tài)。（100×）Figure 2.1 Comparison of normal cells and diseased cells with access to CVA6. (A)is normal RD cell; (B) (C) (D) is a lesion state in which the RD cells becomerounded, agglomerated, and completely floated after the virus is inserted.（100×）2.3.2 CVA6 PCR 結(jié)果將經(jīng)過細(xì)胞擴(kuò)增出現(xiàn)病變效應(yīng)的病毒液收集并用腸道病毒通用引物、CVA6特異性引物和 CVA6 VP1 引物進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，26 份出現(xiàn)腸道病毒典型病變效應(yīng)的樣本利用腸道病毒通用引物（EV）進(jìn)行 RT-PCR 后均在 435bp有目的條帶，而其中有 11 份樣本利用 CVA6 特異性引物（CVA6S）進(jìn)行 RT-PCR

2圖 2.2 PCR 效果圖。（A）（B）為腸道病毒通用引物 PCR 結(jié)果圖。（C）為11 株 CVA6 特異性引物 PCR 電泳結(jié)果圖。為（D）11 株 VP1 基因 PCR 電泳結(jié)果圖。 M：DL2000 Marker。Figure 2.2 PCR electropherogram. (A) (B) shows the results of PCR with 26common strains of enteroviruses. (C) PCR results of 11 CVA6-specific primers(D) PCR results of eleven strains of CVA6 VP1 gene. M: DL2000 Marker.

表 2.1 26 份腸道病毒樣本病原體組成Table 2.1 The pathogens of 26 enterovirus sample病毒種類 EV71 CVA16 CVA6陽性標(biāo)本數(shù) 5 6 11所占比（%） 19.23 23.08 42.312.3.3 CVA6 VP1 測序結(jié)果將經(jīng)過純化的 CVA6 VP1 的 PCR 產(chǎn)物送到上海生工生物工程公司進(jìn)行雙向測序，結(jié)果如圖，峰圖無重疊代表測序成功，如圖 2.3，并將測序成功的 11 株CVA6 VP1 的序列信息上傳至 Genbank。具體序列信息見表 2.2。

【參考文獻(xiàn)】

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1 邵天堂;曹蕾;;西平縣147例手足口病實驗室確診病例病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果分析[J];大家健康(學(xué)術(shù)版);2014年17期

2 王曉敏;唐榮;;2010—2012年撫州市手足口病病原檢測情況分析[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);2013年05期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 趙國連;基于貝葉斯方法對與手足口病相關(guān)CVA16的分子進(jìn)化研究[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號：2778892