【摘要】：背景與目的:手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)是一種全球流行的急性傳染性疾病,表現為囊泡侵襲5歲以下兒童的手部、足底及口周。大部分患者癥狀較輕,可以憑借自身的免疫力自愈,但若不加以重視,容易造成腦膜炎和肺水腫等并發(fā)癥并且危及生命。近年來,手足口病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,其致死率也遠遠超過我國其它C類傳染疾病。該病嚴重危害了兒童的生命健康,由此也引起了中國衛(wèi)生部門的高度重視。一直以來,腸道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CVA16)被廣泛地認為是手足口病的主要病原體,而近幾年,柯薩奇病毒A組6型(Coxsackievirus A6,CVA6)誘發(fā)的手足口病病例逐漸增多。由于二代測序技術的發(fā)展,病毒在分子層面的研究不斷深入,計算機的發(fā)展促使生物信息學技術應運而生,采用計算機方法分析生物學問題已經成為當下流行趨勢。應用貝葉斯方法構建的最大可信分支樹與其它方法相比具有更準確、更高效等特點。它通過限定最合適的核苷酸替代模型使系統(tǒng)發(fā)育樹的模型更加精確,同時計算后驗概率使最終得出的數據標準化�；谪惾~斯方法的種種優(yōu)勢,研究人員已將其用于病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析中。在腸道病毒中,基因重組情況普遍存在,病毒通過遺傳信息的轉移適應環(huán)境,產生新的基因型,因此基因重組是病毒變異和進化的重要原因。當下,手足口病的主要病原體EV71的疫苗已應用于臨床,CVA16疫苗也在緊張地研發(fā)中,然而,關于CVA6疫苗的研發(fā)卻鮮少報道。因此,本研究深入了解了CVA6的進化趨勢以及遺傳特征,不僅對手足口病預防和控制具有實用價值,也為疫苗的研發(fā)、藥物靶位的篩選提供理論基礎。材料與方法:本研究共收集了57份長春市2015年手足口病標本,通過逆轉錄PCR對病毒樣本進行分子分型,并對其中11株CVA6 VP1基因進行擴增并測序,將測序結果上傳至Genbank。從Genbank中下載353條帶有明確分離時間以及地點的CVA6 VP1基因序列,用MEGA剪掉多余序列,進行重組檢測、飽和度檢測以及選擇最適合的核苷酸替代模型。將經過預處理的序列通過貝葉斯方法建立最大可信分支樹(maximum clade credibility tree,MCC),并繪制Bayesian skyline plot,分析CVA6 VP1基因的進化特征。從Genbank中下載148條CVA6全基因組序列,經過MEGA比對后用RDP4以及Simplot進行重組分析,進一步探討CVA6的進化趨勢及遺傳特征。結果:本研究從57份手足口病樣本中分離得到11株CVA6,與原始株相比,測序所得的這11株CVA6 VP1基因核苷酸變異率為16.8%-17.6%,氨基酸變異率為3.3%-6.7%。根據貝葉斯方法構建的最大可信分支樹表明1992年至2015年間的CVA6共分為GⅠ-GⅤ五個基因型,GⅣ基因型進一步分為GⅣ-1型和GⅣ-2型,GⅤ基因型進一步分為GⅤ-1型和GⅤ-2型。本研究分離得到的11株CVA6中有10株為GⅤ-2型,1株為GⅣ-2型。中國近年來流行的CVA6為GⅣ-2型和GⅤ-2型,并且以GⅤ-2型為主。CVA6 VP1基因多態(tài)性曲線在1999年及2006有明顯的上升趨勢,在2002年至2005年以及2011年至2015年期間相對平穩(wěn)。CVA6 VP1基因的進化率為平均每年每個位點發(fā)生4.7982E-3次替代事件。CVA6 VP1基因編碼的氨基酸的三位密碼子的突變率分別為0.303、0.105及2.599。對CVA6全基因組進行重組分析,CVA6在編碼結構蛋白的VP1、VP2、VP3、VP4區(qū)域中均發(fā)生不同程度的型內重組,而在非結構蛋白區(qū),基因重組集中發(fā)生于2A、2B和3A區(qū)域,并且在22個重組株中,有15株在2B區(qū)域發(fā)生重組(68.18%)。結論:本研究采用貝葉斯方法,將1992年至2015年間全球CVA6分為GⅠ-GⅤ五個基因型,在2002-2005年以及2011-2015年期間CVA6 VP1基因的遺傳相對穩(wěn)定,并未出現新的基因型。從長春地區(qū)分離的CVA6為GⅣ-2基因亞型(1/11,9.09%)和GⅤ-2基因亞型(10/11,90.90%)。CVA6全基因組的重組分析結果表明,CVA6的型內重組在結構蛋白和非結構蛋白編碼區(qū)均可發(fā)生,但在非結構蛋白編碼區(qū)中重組現象更為普遍。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373
【圖文】：

圖 2.1 正常細胞與接入 CVA6 的病變細胞 CPE 對比圖。（A）為正常 RD 細胞；（B）（C）（D）為 RD 細胞接入病毒后變圓、聚團、全部漂起的病變狀態(tài)。（100×）Figure 2.1 Comparison of normal cells and diseased cells with access to CVA6. (A)is normal RD cell; (B) (C) (D) is a lesion state in which the RD cells becomerounded, agglomerated, and completely floated after the virus is inserted.（100×）2.3.2 CVA6 PCR 結果將經過細胞擴增出現病變效應的病毒液收集并用腸道病毒通用引物、CVA6特異性引物和 CVA6 VP1 引物進行 RT-PCR 擴增。結果顯示，26 份出現腸道病毒典型病變效應的樣本利用腸道病毒通用引物（EV）進行 RT-PCR 后均在 435bp有目的條帶，而其中有 11 份樣本利用 CVA6 特異性引物（CVA6S）進行 RT-PCR

2圖 2.2 PCR 效果圖。（A）（B）為腸道病毒通用引物 PCR 結果圖。（C）為11 株 CVA6 特異性引物 PCR 電泳結果圖。為（D）11 株 VP1 基因 PCR 電泳結果圖。 M：DL2000 Marker。Figure 2.2 PCR electropherogram. (A) (B) shows the results of PCR with 26common strains of enteroviruses. (C) PCR results of 11 CVA6-specific primers(D) PCR results of eleven strains of CVA6 VP1 gene. M: DL2000 Marker.

表 2.1 26 份腸道病毒樣本病原體組成Table 2.1 The pathogens of 26 enterovirus sample病毒種類 EV71 CVA16 CVA6陽性標本數 5 6 11所占比（%） 19.23 23.08 42.312.3.3 CVA6 VP1 測序結果將經過純化的 CVA6 VP1 的 PCR 產物送到上海生工生物工程公司進行雙向測序，結果如圖，峰圖無重疊代表測序成功，如圖 2.3，并將測序成功的 11 株CVA6 VP1 的序列信息上傳至 Genbank。具體序列信息見表 2.2。

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 邵天堂;曹蕾;;西平縣147例手足口病實驗室確診病例病原學監(jiān)測結果分析[J];大家健康(學術版);2014年17期

2 王曉敏;唐榮;;2010—2012年撫州市手足口病病原檢測情況分析[J];華南預防醫(yī)學;2013年05期

相關碩士學位論文 前1條

1 趙國連;基于貝葉斯方法對與手足口病相關CVA16的分子進化研究[D];吉林大學;2016年

本文編號：2778892