【摘要】：本論文主要研究內(nèi)容是提取了I型膠原和II型膠原,分析了二者的性質(zhì),并研究了這兩類膠原對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的緩解作用。以豬蹄筋為原料,依次經(jīng)浸泡、剪碎、脫脂,再經(jīng)過乙酸浸提,鹽析沉淀、透析,獲得豬蹄筋酸溶性膠原(acid soluble collagen,ASC)。將提取ASC的殘?jiān)谝宜釛l件下,利用胃蛋白酶酶解,依次經(jīng)過鹽析沉淀、透析,得到豬蹄筋酶溶性膠原(pepsin soluble collagen,PSC)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,豬蹄筋A(yù)SC和PSC的提取率分別是12.10%和17.39%(以干重計(jì)),二者的紫外光譜最大吸收波長分別為224 nm和209 nm;十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳結(jié)果顯示,二者均有兩條α帶(α_1和α_2);氨基酸分析顯示,二者符合I型膠原的特性;傅里葉變換紅外光譜顯示,二者有相似的吸收峰均符合I型膠原特征吸收峰;圓二色光譜(CD)結(jié)果表明,二者變性溫度分別為39℃和32℃。以上結(jié)果說明豬蹄筋A(yù)SC和PSC符合I型膠原性質(zhì),為典型的I型膠原。以雞胸軟骨為原料,經(jīng)清洗、去骨膜、切碎、脫脂,酸性條件下加入胃蛋白酶酶解,鹽析沉淀、透析,得到雞胸軟骨PSC。對樣品進(jìn)行紫外、紅外、電泳、氨基酸分析、CD檢測及肽質(zhì)譜指紋圖譜分析。結(jié)果表明,雞胸軟骨PSC的提取率是18.51%(以干重計(jì)),紫外最大吸收波長為217 nm;SDS-PAGE電泳圖顯示,膠原含有一條較粗的α帶;氨基酸分析結(jié)果符合II型膠原的特性;圓二色光譜結(jié)果表明,其變性溫度為38℃。以上結(jié)果表明,該方法提取得到的雞胸軟骨PSC符合II型膠原的性質(zhì),為II型膠原。建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型。C57BL/6 J小鼠隨機(jī)均分為7組:空白組、模型組、I型膠原組、I型膠原+Na_2SeO_3組、II型膠原組、II型膠原+Na_2SeO_3組、Na_2SeO_3組。致炎后,每3d稱量并記錄體重,每3d對小鼠右后足進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分,于加強(qiáng)免疫后第35d全部處死、收集血清,測定血清中部分促炎癥細(xì)胞因子、取右后足趾關(guān)節(jié)進(jìn)行切片病理觀察、取小鼠右后足踝關(guān)節(jié)進(jìn)行掃描微CT、提取小鼠關(guān)節(jié)總RNA進(jìn)行RT-PCR分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白組相比,模型組和I型膠原組小鼠的右后足部炎癥狀況處于加重趨勢,而II型膠原組、II型膠原+Na_2SeO_3組炎癥狀況均有不同程度的減輕;其中,II型膠原+Na_2SeO_3組炎癥緩解情況比較明顯。與模型組相比,I型膠原組小鼠血清中的促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、IкB的含量無顯著性差異(p0.05),而II型膠原+Na_2SeO_3組有顯著改善(p0.05)。小鼠足踝關(guān)節(jié)掃描微CT結(jié)果顯示,與模型組相比,I型膠原組踝關(guān)節(jié)的侵蝕并未減輕,而其他各組均有不同程度的減輕。提取小鼠右后足關(guān)節(jié)軟骨總RNA進(jìn)行RT-PCR分析,結(jié)果顯示,與模型組相比,I型膠原組小鼠關(guān)節(jié)中的促炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α相對mRNA表達(dá)水平無顯著性差異(p0.05),而II型膠原+Na_2SeO_3組的表達(dá)水平與模型組相比有顯著性差異(p0.05)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R593.22;R-33
【圖文】：

膠原電泳結(jié)果圖

證明動物模型構(gòu)建成功。相較于模型組的炎癥狀況，隨著每天的灌胃的持續(xù)進(jìn)行直至采血處死前一天，如圖3-6 所示，II 型膠原+ Na2SeO3組、II 型膠原組、Na2SeO3組右后足紅腫癥狀均有所減輕，而 I 型膠原組小鼠的炎癥情況并沒有明顯變化。3.3.2 小鼠體重變化分析按照 2.2.4.4 中的方法，觀察小鼠生長狀況并記錄。結(jié)果如圖 3-7 所示。試驗(yàn)過程中，初次免疫當(dāng)天記為第 0 天，從第 1 天開始，每 3 天測量一次實(shí)驗(yàn)小鼠的體重，根據(jù)小鼠體重來確定每只小鼠灌胃劑量。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，空白組小鼠體重始終呈緩慢上升趨勢；而其他各組小鼠體重先呈上升趨勢，成功構(gòu)建模型（第 21d 前后）后

Fig. 3-7 Body weight change of mice：I 型膠原組；D：I 型膠原+ Na2SeO3組；E：Na2SeO3組；G：Na2SeO3組 group；C：CI group；D：CI + Na2SeO3group；E：group；G：Na2SeO3group析，對各組小鼠右后足趾進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分。

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