發(fā)布時間：2020-07-28 22:57

【摘要】：目的探討miR-150敲除通過NKT細胞對細菌感染和類風濕關節(jié)炎疾病的影響。方法1采用流式細胞儀分選小鼠胸腺不同發(fā)育階段NKT細胞,提取細胞總RNA,經反轉錄和預擴增后利用TaqMan低密度microRNA表達譜分析檢測NKT發(fā)育、成熟過程中特異microRNAs表達變化,并采用real-time PCR進一步驗證。2采用miR-150基因敲除小鼠(miR-150 KO),以C57BL/6J小鼠作為對照小鼠(WT),制備大腸桿菌感染模型。通過比較細菌感染小鼠的存活率和小鼠肝臟、肺臟細菌數(shù)探討miR-150敲除對小鼠抗感染能力的影響。采用流式細胞術和外周血瑞氏染色檢測大腸桿菌感染miR-150 KO和WT小鼠的NKT細胞和中性粒細胞數(shù)量變化;3采用雞II型膠原和弗氏完全佐劑建立miR-150 KO小鼠和WT小鼠的類風濕關節(jié)炎模型,對小鼠后肢進行測量和病理評分,評估m(xù)i R-150敲除對小鼠類風濕關節(jié)炎發(fā)病進程和嚴重程度的影響;采用流式細胞術檢測miR-150敲除對類風濕關節(jié)炎小鼠NKT細胞、CD4~+T、CD8~+T細胞和B細胞數(shù)量的影響;采用細胞內染色檢測mi R-150敲除對類風濕關節(jié)炎小鼠NKT細胞IFN-γ、IL-4和IL-17表達的影響;采用real-time PCR檢測mi R-150敲除對類風濕關節(jié)炎小鼠關節(jié)腔滑膜液細胞TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-17 mRNA表達的影響。結果1 NKT細胞發(fā)育、成熟過程中,共有92個microRNAs表達發(fā)生顯著變化。表達顯著增加的microRNAs有71個,其中有36個表達持續(xù)增加;而表達顯著降低的microRNAs有21個,其中有12個表達持續(xù)降低。選取Let-7f、miR-150、miR-155、miR-223、miR-24和miR-29進行real-time PCR,發(fā)現(xiàn)Let-7f、miR-150、mi R-24、miR-29在NKT細胞發(fā)育、成熟過程中表達增加,而miR-223和miR-155表達降低,其表達變化趨勢與表達譜分析一致。2與WT小鼠相比,miR-150 KO小鼠在細菌感染后的存活率明顯高于C57BL/6J小鼠,且其肺臟細菌數(shù)明顯少于C57BL/6J小鼠。與WT小鼠相比,miR-150 KO小鼠NKT細胞在細菌感染前后沒有明顯變化,但miR-150 KO小鼠中性粒細胞在細菌感染前后均有顯著增加。3 MiR-150 KO小鼠類風濕關節(jié)炎的發(fā)病率和病情嚴重程度明顯低于WT小鼠;與WT小鼠相比,miR-150 KO小鼠NKT細胞、CD4~+T細胞、CD8~+T細胞和B細數(shù)量無明顯變化,但miR-150 KO小鼠NKT細胞產生的IFN-γ和IL-4顯著增加,而IL-17顯著降低。與WT小鼠相比,miR-150 KO小鼠關節(jié)腔滑膜液中細胞TNF-α和IL-4表達顯著降低,IFN-γ和IL-17也呈表達降低趨勢。結論1 NKT細胞發(fā)育、成熟過程中伴隨大量特異microRNAs的不同表達變化,其中miR-150在NKT此病發(fā)育、成熟過程中表達顯著增加。2 MiR-150敲除可顯著增加小鼠的抗細菌感染能力,其機制可能主要與miR-150敲除導致的中性粒細胞增加有關,而與NKT細胞無明顯關系。3 MiR-150敲除可抑制小鼠類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展,其機制可能與miR-150敲除NKT細胞產生IFN-γ和IL-4顯著增加,而IL-17顯著降低有關。
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

1.2 試驗結果1.2.1 不同發(fā)育階段 NKT 細胞的分選新鮮分離的小鼠胸腺細胞，首先經 Biotin 磁珠陰性選擇除去 CD8+胸腺細胞以達到富集 NKT 細胞的目的，再經 anti-mouse-TCR-FITC antibody、α-GalCer/CD1dtetramer 染色，可得到 CD8+T 細胞剔除后胸腺 NKT 細胞比例（圖 1）增加了 10倍以上；進一步采用 anti-mouse-NK1.1-APC antibody、anti-mouse-CD44-PE-Cy5antibody 染色，發(fā)現(xiàn) C57BL/6J 小鼠胸腺中 NKT 細胞以成熟 stage 3（CD44+NK1.1+）為主，比例在 85%以上；非成熟 stage 1（CD44-NK1.1-）和 stage 2（CD44+NK1.1-）NKT 細胞的比例分別為 2%和 10%，表明 NKT 細胞發(fā)育正常（圖 2）。經 FACSAria II 流式細胞儀分選得到的不同發(fā)育階段的 NKT 細胞，純度在 90%以上，可以用于后續(xù) microRNA 表達譜的分析。

圖 2 胸腺中不同發(fā)育階段的 NKT 細胞比例e percentage of thymus NKT cells at different developmen成熟過程中 microRNA 表達譜的變化到的不同發(fā)育階段的 NKT 細胞，提取總 RNA cDNA，并將其分別加入到 miRNA 分析陣列板程中 microRNA 表達譜的變化（圖 3）。分析ge 1 到成熟的 stage 3 過程中，顯著表達變化的 stage 1 相比，stage 3 中表達顯著增加的 mic降低的 microRNAs 有 21 個（表 6）。

圖 2 胸腺中不同發(fā)育階段的 NKT 細胞比例Fig.2 The percentage of thymus NKT cells at different developmental stages 細胞發(fā)育成熟過程中 microRNA 表達譜的變化ACS 分選得到的不同發(fā)育階段的 NKT 細胞，提取總 RNA，經反轉錄得到對應的 cDNA，并將其分別加入到 miRNA 分析陣列板 A 和 B 中細胞發(fā)育過程中 microRNA 表達譜的變化（圖 3）。分析結果顯示，成熟的 stage 1 到成熟的 stage 3 過程中，顯著表達變化的 microRN其中，與 stage 1 相比，stage 3 中表達顯著增加的 microRNAs 有表達顯著降低的 microRNAs 有 21 個（表 6）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 鄭全輝;張愛紅;鄭愛華;陸斌;張慶波;侯志宏;李娟;陳淑媛;;MiR-150特異調控胸腺iNKT細胞的發(fā)育和成熟[J];中國免疫學雜志;2013年02期

本文編號：2773553