【摘要】：目的:本文旨在探索造血系統(tǒng)特異性敲除beclin1雙等位基因后,對胚胎期造血器官肝臟及骨髓的影響,對骨髓造血干祖細胞數(shù)量及功能的影響,對各類功能性血細胞的影響。方法:(1)構(gòu)建造血系統(tǒng)特異性敲除beclin1雙等位基因的小鼠模型。采用造血系統(tǒng)特異性表達的Vav啟動子,啟動Cre酶的表達,實現(xiàn)特異性敲除beclin1基因的第四號外顯子到第七號外顯子之間的序列,實現(xiàn)移碼突變,使beclin1基因功能喪失。(2)利用聚合酶鏈式反應(PCR)對從鼠尾中提取的基因組DNA進行擴增,通過瓊脂糖凝膠電泳進行基因型鑒定。(3)將beclin1~(f/f)小鼠與beclin1+/f;Vav-iCre小鼠(本文簡寫為beclin1+/f)進行雜交,對孕鼠進行麻醉脫臼處死,剖腹產(chǎn)取出圍產(chǎn)期18.5天的胎鼠進行相關實驗。(4)通過蘇木精-伊紅染色法(HE染色法)檢測胎鼠肝臟的病理學變化。將胎肝取出后置于4%多聚甲醛(PFA)中進行固定,或?qū)⒄惶ナ笾糜?%PFA中進行固定,檢測造血系統(tǒng)beclin1雙等位基因的敲除對胎肝等造血器官的影響。(5)通過三分類全自動血液分析儀對胚胎期18.5天的胎鼠外周血中各類血細胞指標進行檢測。(6)通過多色流式細胞分析儀對18.5天的胎鼠骨髓中的造血干細胞及造血祖細胞群的數(shù)量和比例進行檢測分析。(7)通過體外克隆形成實驗(CFU)對胚胎期18.5天的胎鼠骨髓中長程造血干細胞及單個核細胞的克隆形成能力進行檢測。結(jié)果:(1)我們首先成功構(gòu)建了beclin1~(f/f)小鼠以及beclin1+/f;Vav-iCre小鼠,將兩種基因型小鼠雜交,所產(chǎn)生的子代中有基因型為beclin1~(f/f);Vav-iCre(本文簡寫為beclin1-/-)的小鼠,即造血系統(tǒng)中beclin1雙等位基因敲除的胎鼠。由于純合敲除小鼠在圍產(chǎn)期18.5-19.5天全部死亡,我們選取胚胎期18.5天的胎鼠進行后續(xù)功能檢測。(2)beclin1~(f/f);Vav-iCre胎鼠的鼠尾基因組DNA,通過基因型鑒定可以檢測出基因敲除條帶,表明beclin1被成功敲除;凡是不帶Vav啟動子的小鼠即野生型小鼠(本文簡稱為WT)無敲除條帶。(3)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠與野生型小鼠相比,體型偏小,顏色發(fā)白。(4)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠,胎肝的中央血管中紅細胞數(shù)量稀少,血竇不豐富,含有數(shù)量較多的有核細胞,存在髓外造血。肝臟在胚胎期15.5天開始出現(xiàn)缺血性壞死灶,在肝臟外觀上表現(xiàn)為白色斑塊。(5)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠外周血中,白細胞和淋巴細胞計數(shù)增多,紅細胞計數(shù)顯著減少并且紅細胞指標異常,血小板計數(shù)增多但血小板功能異常。(6)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠骨髓中造血干祖細胞群比例明顯降低。(7)CFU實驗表明胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre胎鼠,骨髓中的長程造血干細胞及單個核細胞均失去克隆形成能力,骨髓造血重建能力嚴重受阻。結(jié)論:造血系統(tǒng)特異性敲除beclin1雙等位基因的小鼠,由于造血功能衰竭,導致純合敲除小鼠在圍產(chǎn)期全部死亡。純合敲除小鼠骨髓中的HSCs比例顯著降低,并且骨髓中HSCs造血重建能力嚴重受阻,完全分化的功能性血細胞計數(shù)及其參數(shù)異常。這些結(jié)果表明了Beclin1在胚胎期造血中的重要作用。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R363
【圖文】：

驗結(jié)果 Vav-iCre 啟動子介導的自噬基因特異性敲除對小鼠造血系統(tǒng)影響的初步活。從而提示 beclin1-/-小鼠在胚胎期 18.5 天至胚胎期 19.5 天之間死亡。于妊 18.5 天對孕鼠麻醉頸椎脫臼處死后，剖腹產(chǎn)取出胎鼠，發(fā)現(xiàn) beclin1-/-胎鼠體顯減小，身體發(fā)白（圖 2），推測造血系統(tǒng)中特異性敲除 beclin1 雙等位基因胎鼠產(chǎn)生嚴重的貧血癥狀。

lin1f/f與 beclin1+/f;Vav-icre 親本雜交所獲得的 600 多只胎鼠的基因型，19.5 天出生小鼠中無 beclin1-/-基因型小鼠，各基因型比例 WT：be-/-=67.7%：32.3%：0.0%；胚胎期 18.5 天的胎鼠各基因型比例 WT：bebeclin1-/-=51%：26.2%：22.4%。

圖 3. beclin1f/f;Vav-iCre 胎鼠體型偏小，顏色發(fā)白A）胚胎期 18.5 天野生型小鼠肝臟切片中血竇豐富，beclin1-/-小鼠的肝臟中中央血管中紅細胞數(shù)量稀少，血竇減少，有核細胞（黑色箭頭所指）明顯增多（上方切片放大倍數(shù)為 20 倍，下方切片放大倍數(shù)為 40 倍）；B）通過流式細胞分析儀對胎肝細胞及骨髓細胞中的有核細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)肝臟中該細胞比例增多，但骨髓中的有核細胞比率無差異。** P < 0.01

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