【摘要】：[背景]腸道病毒(Enterovirus,EV)是小核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)病毒目(Picornavirales)小 RNA 病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)中最常見(jiàn)的人類(lèi)病原體之一,目前分為12個(gè)組,分別為腸道病毒A～H,J和鼻病毒A～C。EV在自然界中廣泛存在,多數(shù)血清型都能夠感染人類(lèi)并可引起多種疾病。盡管人體感染EV后通常無(wú)明顯的臨床癥狀,但部分感染病例可出現(xiàn)急性弛緩性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)、手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)、無(wú)菌性腦膜炎(Aseptic Meningitis,AM)、急性出血性結(jié)膜炎(Acute Hemorrhagic Conjunctivitis,AHC)、皰疹性咽峽炎、心肌炎、I 型糖尿病、流行性肌痛等,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。EV-A所致疾病以手足口病最為常見(jiàn),多發(fā)于5歲以下嬰幼兒,可引起發(fā)熱和手、足及口腔部位的皮疹、潰瘍等。在手足口病的病原譜中,腸道病毒71型(EV-A71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)是導(dǎo)致該疾病暴發(fā)和流行的兩大主要病原體。EV基因組為單股正鏈RNA,包括5'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(5'-NontranslatedRegion,5'-NTR)、編碼多聚蛋白的單一開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)和3'-NTR共3個(gè)部分,全長(zhǎng)約7.5kb。單一的ORF編碼的多聚蛋白包括4個(gè)衣殼結(jié)構(gòu)蛋白(VPl～VP4)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(2A-2C和3A-3D)。其中,VP1蛋白位于病毒衣殼的最外側(cè),在病毒抗原性和致病性等方面發(fā)揮重要作用。目前,根據(jù)EV完整或部分VP1序列的分子生物學(xué)定型方法得到廣泛應(yīng)用,該方法通過(guò)對(duì)VP1核苷酸序列擴(kuò)增后測(cè)序,并進(jìn)一步與其他已知血清型別進(jìn)行序列比對(duì)實(shí)現(xiàn)EV血清型別鑒定。近些年,基于VP1序列的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析被認(rèn)為是開(kāi)展EV分子流行病學(xué)研究及進(jìn)化分析的可靠方法,并用于相關(guān)變異株及新型EV的鑒定。在EV基因重組與進(jìn)化研究方面,基于貝葉斯理論的BEAST程序,可以對(duì)病毒的起源和進(jìn)化速度等參數(shù)進(jìn)行詳細(xì)計(jì)算分析,初步應(yīng)用于EV的進(jìn)化起源研究中。運(yùn)用貝葉斯的馬爾可夫鏈蒙特卡爾(Markov Chain Monte Carlo,MCMC)方法,能夠?qū)V不同血清型的進(jìn)化遺傳學(xué)特征(如基因序列起源、進(jìn)化速度、流行史重構(gòu)、居群動(dòng)力學(xué)特征等)進(jìn)行分析。此外,系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)(Phylogeography)是將研究對(duì)象不同來(lái)源的信息與相關(guān)序列數(shù)據(jù)結(jié)合在一起進(jìn)行進(jìn)化重建分析的過(guò)程,這種分析方法在模擬各種傳染病傳播及流行史重構(gòu)研究中得到廣泛應(yīng)用。目前,系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)分析多用于物種進(jìn)化歷史及地理遷移信息的重建。在傳染病研究中,則更多地集中于模擬蟲(chóng)媒傳播疾病的時(shí)空擴(kuò)散。對(duì)EV開(kāi)展系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)特征分析并利用BEAST軟件的貝葉斯隨機(jī)搜索變量選擇(Bayesian Stochastic Search Variable Selection,BSSVS)模型開(kāi)展 EV 系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)特征分析,能夠初步探索不同血清型別EV在不同地域間的時(shí)空演變過(guò)程。EV-A涵蓋近25個(gè)血清型別,其中EV-A71、CV-A16等多個(gè)型別曾在世界范圍內(nèi)引起相關(guān)疾病的暴發(fā)流行。由于目前全球EV-A毒株數(shù)量較少,EV-A多數(shù)血清型的分子流行病學(xué)特征研究仍存有一定的局限性。山東省疾病預(yù)防控制中心(CDC)在過(guò)去近30年里積累了豐富的EV-A分離株,并且所有毒株均具有完整翔實(shí)的毒株信息。因此,現(xiàn)階段對(duì)EV-A開(kāi)展較為深入的分子流行病學(xué)研究,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行深入的進(jìn)化遺傳學(xué)研究和系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)研究,對(duì)于EV所致相關(guān)疾病的機(jī)制及預(yù)防控制將具有重要的理論和實(shí)際意義。[研究目的]1.探索EV-A不同血清型山東株在山東省內(nèi)的時(shí)間循環(huán)模式及其與疾病的關(guān)系。2.構(gòu)建并完善EV-A山東株12個(gè)血清型(CV-A2、CV-A4、CV-A5、CV-A6、CV-A8、CV-A10、CV-A12、CV-A14、CV-A16、EV-A71、EV-A76 和 EV-A90)毒株VP1區(qū)和3D區(qū)基因數(shù)據(jù)庫(kù),并對(duì)以上血清型毒株進(jìn)行基因特征研究。3.分析EV-A山東株基因重組的發(fā)生,探討病毒遺傳變異對(duì)其致病性和流行規(guī)律的影響。4.基于貝葉斯理論的MCMC分析方法,分析EV-A山東株的進(jìn)化遺傳學(xué)特征(基因序列起源、進(jìn)化速度、重構(gòu)流行史、居群動(dòng)力學(xué)等)。5.根據(jù)貝葉斯BSSVS模型探討EV-A的系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)特征,分析EV-A不同血清型的時(shí)空動(dòng)態(tài)傳播過(guò)程。[研究方法]1.毒株分離:本研究所選毒株來(lái)自山東省CDC1989～2016年分離到的EV-A毒株。病毒株于-80℃低溫冰柜冷凍保存,實(shí)驗(yàn)前接種RD或Hep-2細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖。2.病毒RNA提取:采用美國(guó)QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒,從140μl細(xì)胞培養(yǎng)物中提取50μl病毒RNA,加1 μl(40U)Rnasin((QIGEN)后儲(chǔ)存于-80℃。3.RT-PCR 及基因測(cè)序:RT-PCR 采用美國(guó) Promega 公司 Access RT-PCR System試劑盒擴(kuò)增VP1和3D區(qū)基因片段,RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。4.型別鑒定:EV型別鑒定采用基于VP1序列的分子學(xué)定型方法,使用NCBI在線提供的BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì),確定EV-A山東株的血清型別。5.生物信息學(xué)分析:使用MEGA 6.0軟件,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,探討EV-A山東株基因重組情況。通過(guò)BEAST 1.8.3軟件分析EV-A山東株進(jìn)化遺傳學(xué)特征,使用貝葉斯天際線圖開(kāi)展居群動(dòng)力學(xué)特征分析。采用貝葉斯BSSVS模塊對(duì)EV-A時(shí)空動(dòng)態(tài)傳播過(guò)程進(jìn)行估計(jì),并在SPREAD 1.0.6軟件中模擬EV-A的溯源及時(shí)空動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)。[主要結(jié)果]1.EV-A山東株血清型分布:通過(guò)EV分子生物學(xué)定型方法對(duì)1989～2016年分離自山東省AFP及相關(guān)病例標(biāo)本的EV-A山東株進(jìn)行型別鑒定,共鑒別出EV-A 山東株 251 株,涵蓋 12 個(gè) EV 血清型別(CV-A2、CV-A4、CV-A5、CV-A6、CV-A8、CV-A10、CV-A12、CV-A14、CV-A16、EV-A71、EV-A76 和 EV-A90)。其中,EV-A71、CV-A4、CV-A10、CV-A16、CV-A6、CV-A2 等 6個(gè)血清型在山東省歷年EV監(jiān)測(cè)中共分離到237株,為EV-A山東株優(yōu)勢(shì)血清型別。自2008年以來(lái),EV-A在山東省內(nèi)流行活躍,共分離到223株,占EV-A山東株的88.8%。2.EV-A山東株分子進(jìn)化及基因重組分析:本研究共選取251株EV-A山東株進(jìn)行VP1和3D區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化和基因重組分析。構(gòu)建VP1區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn),山東省12個(gè)EV-A血清型毒株在進(jìn)化樹(shù)上根據(jù)遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近的不同聚為不同的分支,未發(fā)現(xiàn)EV-A山東株在VP1區(qū)重組的證據(jù)。EV-A不同血清型毒株在山東省的流行具有時(shí)間動(dòng)力學(xué)特征,即不同年代的EV-A分離株在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中位于不同的進(jìn)化分支。通過(guò)構(gòu)建EV-A山東株3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn),山東分離株在非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)存在頻繁的基因重組現(xiàn)象。按照EV-A山東地方株在進(jìn)化樹(shù)中親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,我們將EV-A山東株在3D進(jìn)化樹(shù)上進(jìn)一步分為10個(gè)基因簇(1～10)。(1)3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示,每個(gè)基因組所包含山東株血清型別不盡相同,而且同一型別的山東分離株在3D進(jìn)化樹(shù)中分處不同的基因組。EV-A山東株3D編碼區(qū)不同基因組優(yōu)勢(shì)山東株的分離時(shí)間也不完全相同,其最長(zhǎng)分離時(shí)間跨度為25年,各基因組平均分離時(shí)間跨度約為10年(10.4±7.6年)。(2)基因簇1包含毒株分離自2003～2015年,其中除1株CV-A12山東株(F424)外,其余毒株均為EV-A71。基因簇2的病毒成員分離自1996～2011年,除包含CV-A4、CV-A14和CV-A16這3個(gè)血清型的原型株外,還包含1株CV-A6和5株CV-A12山東株。基因簇3也是山東株3D序列進(jìn)化樹(shù)中的優(yōu)勢(shì)基因組,山東株分離時(shí)間跨度為1992～2015年,由CV-A2、CV-A4、CV-A6、CV-A10、CV-A14等4個(gè)血清型的山東株組成�；虼�10由EV-A76和EV-A90兩個(gè)型別的山東株組成,EV-A76血清型為1株2005年分離到的毒株,其余4株EV-A90為1999～2003年分離獲得。3.EV-A優(yōu)勢(shì)血清型進(jìn)化起源分析:本研究所選CV-A2、CV-A4、CV-A6、CV-A10、CV-A16和EV-A71等6個(gè)EV-A優(yōu)勢(shì)血清型毒株的祖先分別起源于1925年、1944年、1946年、1904年、1905年和1936年。近10年以來(lái),EV-A優(yōu)勢(shì)血清型山東株VP1區(qū)遺傳多樣性增大。不同EV-A血清型VP1區(qū)核苷酸序列每年每個(gè)堿基位點(diǎn)的平均進(jìn)化速度為2.615×10-3～6.431×10-3,其中EV-A71平均進(jìn)化速度最低,而CV-A4VP1區(qū)平均進(jìn)化速度最高。此外,同一血清型不同分支毒株的VP1區(qū)平均進(jìn)化速度不同。EV-A優(yōu)勢(shì)血清型山東株在進(jìn)化起源上與來(lái)自中國(guó)其他省份分離株存在共同的進(jìn)化祖先。4.EV-A優(yōu)勢(shì)血清型時(shí)空動(dòng)態(tài)傳播分析:近些年,EV-A在全球范圍內(nèi)的傳播速度明顯加快。基于現(xiàn)有基因序列分析發(fā)現(xiàn),除CV-A16在全球范圍內(nèi)的傳播最先起源于南非共和國(guó)外,全球CV-A2、CV-A4、CV-A6、CV-A10和EV-A71的傳播可能最初均起源于美國(guó)。EV-A優(yōu)勢(shì)血清型最先起源的傳播分支已“靜默”多年,目前全球 CV-A2、CV-A4、CV-A6、CV-A10、CV-A16 和 EV-A71 的流行多集中分布在亞洲-太平洋地區(qū)和歐洲地區(qū)。EV-A的時(shí)空傳播具有明顯的地域特征,表現(xiàn)為同一地域內(nèi)的傳播要優(yōu)先于不同地域間的傳播。[主要結(jié)論]1.山東省EV監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)多種EV-A血清型,其中以EV-A71、CV-A4、CV-A10、CV-A16、CV-A6、CV-A2等6個(gè)血清型為主。本研究共分離到251株EV-A山東分離株,分屬12個(gè)血清型,即CV-A2、CV-A4、CV-A5、CV-A6、CV-A8、CV-A10、CV-A12、CV-A14、CV-A16、EV-A71、EV-A76、EV-A90。分離自AFP監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的毒株涵蓋上述所有血清型別;來(lái)自HFMD病例的毒株型別以EV-A71和CV-A16為主;AM病例的感染毒株以EV-A71為主;感染皰疹性咽峽炎病例的EV-A血清型別主要為CV-A10和CV-A6。2.EV-A山東分離株與國(guó)外分離株具有較大的核苷酸差異,基因重組是EV-A非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)重要的進(jìn)化方式。EV-A山東分離株在進(jìn)化關(guān)系上具有一定的時(shí)間聚集性和空間聚集性,與國(guó)外分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。構(gòu)建3D區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn),EV-A山東株非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因片段轉(zhuǎn)移頻繁,存在頻繁的基因重組現(xiàn)象。EV-A山東株在進(jìn)化樹(shù)中分為10個(gè)基因簇,每個(gè)基因簇所包含山東株血清型種類(lèi)和數(shù)量不同,同一血清型山東株分處不同的基因組。3.EV-A山東株優(yōu)勢(shì)血清型VP1區(qū)遺傳變異活躍,山東省存在多個(gè)傳播鏈的共同流行。系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),EV-A優(yōu)勢(shì)血清型的共同祖先起源于1904～1946年間,VP1區(qū)每年每個(gè)堿基的平均進(jìn)化速率為2.6×10-3-6.4×10-3,并且同一血清型不同分支的進(jìn)化速度并不一致。4.EV-A時(shí)空動(dòng)態(tài)傳播具有一定的地域性特征,近些年來(lái)傳播速度明顯加快。根據(jù)現(xiàn)有基因序列分析,多數(shù)EV-A血清型毒株可能起源于美國(guó),而目前EV-A流行區(qū)域多集中在亞洲-太平洋地區(qū)和歐洲地區(qū)。5.建議我國(guó)加強(qiáng)對(duì)EV-A各血清型的監(jiān)測(cè),開(kāi)展系統(tǒng)的分子流行病學(xué)研究工作。鑒于EV-A毒株在世界范圍內(nèi)流行日趨活躍,我國(guó)近些年EV所致疾病更為嚴(yán)重,理應(yīng)加強(qiáng)EV病原學(xué)、流行病學(xué)等系統(tǒng)的研究工作,以期為EV所致疾病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立、疫情預(yù)測(cè)預(yù)警和疫苗的研發(fā)等防控措施提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R373.2
【圖文】：

由一非封閉的衣殼所包被⑴。ＥＶ基因組包括３個(gè)部分：５’端非編碼區(qū)（５’逡逑ＮｏｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄＲｅｇｉｏｎ，５＇－ＮＴＲ），編碼多聚蛋白的單一開(kāi)放閱讀框（Ｏｐｅｎ邋Ｒｅａｄｉｎｇ逡逑Ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）和３＇－ＮＴＲ邋（圖１）。病毒基因組的５＇端不具有一般真核生物ｍＲＮＡ逡逑的帽子結(jié)構(gòu)，但在３’端有多聚腺苷酸（ｐｏｌｙＡ）尾，對(duì)病毒的感染性具有重要意逡逑義。５＇－ＮＴＲ有基因組ＲＮＡ合成起始的位點(diǎn)和翻譯時(shí)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)Ｐ４。逡逑編碼區(qū)分為結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)（Ｐ１）和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)（Ｐ２、Ｐ３）。結(jié)構(gòu)蛋白編碼逡逑區(qū)依次編碼ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３和ＶＰ１共４個(gè)衣殼結(jié)構(gòu)蛋白Ｍ。衣殼蛋白不僅含有逡逑抗原決定位點(diǎn)，而且還決定病毒的組織嗜性，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的吸附和進(jìn)入［６］。逡逑其中，ＶＰ１、ＶＰ２和ＶＰ３均暴露于病毒表面，具有黏附作用，同樣也是中和抗體逡逑的主要結(jié)合位點(diǎn)；ＶＰ４雖然不暴露在病毒衣殼表面，但卻與病毒感染細(xì)胞的穿入逡逑和脫衣殼過(guò)程有關(guān)系ＥＶ基因結(jié)構(gòu)中的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)主要負(fù)責(zé)編碼所有逡逑與病毒復(fù)制、繁殖以及病毒顆粒裝配有關(guān)的酶類(lèi)等物質(zhì)，并在ＥＶ核酸復(fù)制、細(xì)逡逑胞器修飾以及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮多種不同的功能。其中３Ｄ區(qū)位于ＥＶ基因組逡逑結(jié)構(gòu)的３＇端，主要編碼ＲＮＡ依賴(lài)的ＲＮＡ聚合酶，該聚合酶在病毒ＲＮＡ合成中逡逑有重要作用。此外，ＥＶ基因組結(jié)構(gòu)中的３’非編碼區(qū)主要負(fù)責(zé)互補(bǔ)ＲＮＡ合成的逡逑起始逡逑１６逡逑

逡逑（２）分別構(gòu)建邋ＥＶ－Ａ１２邋個(gè)血清型山東株（ＣＶ－Ａ２、ＣＶ－Ａ４、ＣＶ－Ａ５、ＣＶ－Ａ６、逡逑ＣＶ－Ａ８、ＣＶ－Ａ１０、ＣＶ－Ａ１２、ＣＶ－Ａ１４、ＣＶ－Ａ１６、ＥＶ－Ａ７１、ＥＶ－Ａ７６、ＥＶ－Ａ９０）逡逑的ＶＰ１區(qū)和３Ｄ區(qū)基因數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)以上血清型毒株進(jìn)行基因特征研宄。逡逑（３）通過(guò)比較ＶＰ１區(qū)和３Ｄ區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)特征，分析ＥＶ－Ａ山東株基因重逡逑組的發(fā)生以及病毒遺傳變異對(duì)其致病性和流行規(guī)律的影響。逡逑（４）運(yùn)用基于貝葉斯理論的ＭＣＭＣ方法，分析ＥＶ－Ａ山東株的進(jìn)化遺傳學(xué)逡逑特征（基因序列起源，進(jìn)化速度，重構(gòu)流行史等），并開(kāi)展居群動(dòng)力學(xué)研究。逡逑（５）采用ＢＥＡＳＴ軟件的ＢＳＳＶＳ模型探討ＥＶ－Ａ山東株的系統(tǒng)發(fā)生生物地逡逑理學(xué)特征，分析不同血清型別毒株的起源及時(shí)空關(guān)聯(lián)特征，掌握ＥＶ－Ａ病毒在不逡逑同地域間的空間傳播過(guò)程，從人群健康角度對(duì)相關(guān)疾病的預(yù)防控制及預(yù)警機(jī)制的逡逑建立提供理論支持。逡逑

圖３本研宄技術(shù)路線圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３邋Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｒｏｕｔｅ邋ｏｆ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ逡逑

本文編號(hào)：2757633