【摘要】：背景:軟骨是人體運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中最重要、最復(fù)雜的成分之一。由于交通意外、人口老齡化,創(chuàng)傷、退行性變?cè)斐傻年P(guān)節(jié)軟骨損傷日益增加。軟骨損傷一旦發(fā)生,將引起強(qiáng)烈的關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)僵直。軟骨損傷所造成的病痛大大降低了患者的活動(dòng)能力及生活質(zhì)量。再加上軟骨自愈和再生能力極低。傳統(tǒng)方法療效不佳。組織工程作為一門新興的交叉學(xué)科,被應(yīng)用于軟骨損傷的修復(fù),取得了令人振奮的效果,為軟骨損傷的治療開辟了新的途徑和思路。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是目前較為理想的軟骨組織工程的種子細(xì)胞。骨骼系統(tǒng)的發(fā)育以及骨與軟骨修復(fù),依賴于BMSC的分化。BMSCs的分化受不同的分子機(jī)制調(diào)控,其中Runx2、Sox9等因子對(duì)BMSC分化起重要調(diào)控作用。BMSC的分化異常將導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常、骨不連或軟骨缺損。因此研究MSCs的成軟骨分化具有重要意義。隨著沖擊波(ESW)治療在臨床應(yīng)用越來越多,人們發(fā)現(xiàn)沖擊波在治療疾病中應(yīng)用的遠(yuǎn)不止碎石。自20世紀(jì)90年代早期以來,ESW開始用于在骨科治療骨組織和骨骼周圍軟組織的疾病,取得了良好的效果。但是沖擊波產(chǎn)生生物效應(yīng)的具體機(jī)制尚不明確,可能與沖擊波影響干細(xì)胞分化有關(guān)。腺苷存在于身體的各種組織和器官,發(fā)揮重要生物學(xué)作用。腺苷通過與細(xì)胞表面的四個(gè)腺苷受體結(jié)合,激活下游通路來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。A1和A3腺苷受體(A1AR和A3AR)與Gαi偶聯(lián),受腺苷酸環(huán)化酶抑制;而A2A和A2B腺苷受體(A2AAR和A2BAR)與Gαs偶聯(lián),Gαs刺激腺苷酸環(huán)化酶并產(chǎn)生c AMP信號(hào)。A1AR、A2AAR和A2BAR在MSC中表達(dá)。A2AAR和A2BAR在軟骨細(xì)胞中高表達(dá)。四種腺苷受體親和力不同,A2BAR親和力最低。A2BAR及其相關(guān)的信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中有重要作用。A2BAR能刺激MSCs的成骨細(xì)胞分化,抑制MSCs的破骨細(xì)胞分化和功能。腺苷受體在軟骨細(xì)胞分化中的作用尚未被研究和報(bào)告。然而,由于A1AR、A2AAR和A2BAR在MSCs表達(dá),在加上腺苷受體對(duì)Runx2及Sox9的影響,可以推測(cè)腺苷受體在MSCs向軟骨細(xì)胞分化中起到重要的作用目前還不清楚沖擊波對(duì)MSCs軟骨細(xì)胞分化產(chǎn)生的影響。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),沖擊波能釋放h MSCs細(xì)胞內(nèi)ATP,激活P2X7受體及其下游信號(hào)通路,促進(jìn)h MSCs成骨細(xì)胞分化。ATP在胞外很快被降解成腺苷,因此我們推測(cè)沖擊波能夠通過腺苷發(fā)揮一定的作用。目的:使用沖擊波作用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,探索其能否影響MSCs的軟骨分化,以及腺苷與其受體在此過程中所起的作用。方法:1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs的表面標(biāo)記。2、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色鑒定所分離培養(yǎng)細(xì)胞的成骨分化能力。3、甲苯胺藍(lán)染色、II型膠原的免疫組化鑒定所分離培養(yǎng)細(xì)胞的成軟骨分化能力。4、油紅染色鑒定所分離培養(yǎng)細(xì)胞的成軟骨分化能力。5、CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增值率;臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)ESW對(duì)MSC活性的影響。6、ELISA測(cè)量沖擊波對(duì)h MSCs的細(xì)胞外ATP、ADP、AMP、腺苷、HIF-α及IL-6的含量的影響。7、Western blotting檢測(cè)沖擊波對(duì)h MSCs的腺苷受體表達(dá)水平的影響。8、Real-time PCR檢測(cè)沖擊波在對(duì)h MSCs的SOX6,Sox9,COL1A2,COL2A1,ACAN及Runx2 m RNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定:MSCs能貼塑料瓶壁生長(zhǎng);流式細(xì)胞儀檢g謁拇赴礱嬋乖

本文編號(hào)：2749588