發(fā)布時間：2020-06-28 01:47

【摘要】：單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)是引起人類皮膚性疾病的常見病原體。人類是HSV感染的唯一宿主。HSV主要感染人類面部以及生殖器部位的皮膚和黏膜,能引起口唇皰疹、口腔黏膜炎、角膜炎、生殖器皰疹甚至皰疹性腦炎等。另外,研究證實HSV感染與流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎、死胎、新生兒感染以及宮頸癌、阿爾茨海默等多種疾病密切相關。HSV是一種具有囊膜結(jié)構的線性雙鏈DNA病毒。根據(jù)血清型不同,HSV可分為Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1和HSV-2)。據(jù)統(tǒng)計,成人HSV-1血清抗體陽性率高達90%。另外,HSV-2感染導致的生殖器皰疹不僅是一種性傳播疾病(sexually transmitted disease, STD),并且其感染還能顯著增加艾滋病病原體HIV (human immunodeficiency virus)的傳播。HSV具有裂解性感染和潛伏感染兩種方式。當裂解性感染癥狀消退后,部分病毒沿軸突上行至神經(jīng)節(jié)并建立潛伏感染,并能逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)測。當機體免疫功能低下或受到外界壓力時,潛伏感染的病毒被激活導致復發(fā)。 目前沒有可用于防治HSV的疫苗,臨床治療HSV感染的藥物主要為核苷類似物,包括阿昔洛韋及其衍生物泛昔洛韋等。雖然這些核苷類似物能特異性阻斷病毒DNA復制過程,但是也存在很多缺陷,例如靶點單一,生物利用度低,半衰期短以及嚴重的副反應等。另外,這些藥物不能防止病毒的潛伏感染和復發(fā)頻率,對于突變株病毒的感染,這些核苷類似物將會完全失效。因此尋找作用廣泛、毒副作用小的抗HSV藥物十分重要。 天然產(chǎn)物來源廣泛,并且具有簡便易得、低毒等特點。因此,天然產(chǎn)物是尋找抗病毒活性成分的重要資源。目前,對于天然產(chǎn)物特別是植物提取物抗病毒的研究很多,但是大多停留在簡單篩選水平。本研究旨從天然產(chǎn)物包括中草藥以及植物代謝產(chǎn)物中篩選具有抑制HSV感染的候選藥物,并進一步尋找抗病毒活性化合物,研究抗病毒感染作用機理,為有效開發(fā)利用天然產(chǎn)物作為抗病毒先導化合物和抗病毒藥物提供基礎。 我們從中國傳統(tǒng)中草藥中篩選到藥食兩用的魚腥草植物水提物(water extract of Houttuynia cordata, HCWE)具有顯著抗HSV感染作用,其半數(shù)抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration, IC50)為50μg/ml。NF-κB (nuclear factor-κB)作為HSV病毒復制過程中所需的轉(zhuǎn)錄因子,抑制其轉(zhuǎn)錄活化,能夠抑制病毒的感染。通過核漿蛋白分離實驗我們發(fā)現(xiàn),HSV-2感染6小時開始明顯誘導細胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化進核,HCWE處理組能顯著抑制病毒感染誘導的NF-κB的活化。免疫熒光、免疫印跡以及PFU (plaque forming unit)實驗結(jié)果顯示,HCWE特異性抑制病毒感染過程中NF-κB的活化,而不影響病毒感染誘導的MAPKs (mitogen-activated protein kinase)通路的活化,從而降低感染性病毒顆粒的產(chǎn)生和病毒蛋白的表達。通過HPLC (high performance liquid chromatography)化學分析,我們進一步鑒定出水提物中的主要黃酮類化合物槲皮素、槲皮苷以及異槲皮苷可能為抑制HSV感染的有效活性成分。 另外,多酚類化合物白藜蘆醇和其寡聚體廣泛分布于植物中,是植物的次級代謝產(chǎn)物,具有廣泛的生物功能。我們篩選了32種從植物中分離鑒定出的白藜蘆醇衍生物的抗病毒活性,并發(fā)現(xiàn)10種白藜蘆醇寡聚體具有顯著抑制HSV-1和HSV-2感染作用。其抑制HSV-2的IC50均低于5μM。利用流式細胞術方法,我們檢測到白藜蘆醇寡聚體能顯著性地短暫誘導活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生。通過添加活性氧的清除劑NAC (N-acetylcysteine)能有效逆轉(zhuǎn)化合物的抗病毒感染作用。這些結(jié)果說明,化合物能夠通過誘導產(chǎn)生ROS,從而抑制HSV的感染。這也預示著ROS可能作為信號分子在抗病毒感染過程中發(fā)揮積極作用。但是化合物通過何種途徑誘導ROS的產(chǎn)生以及ROS在抗病毒感染過程中的具體作用還需要進一步研究。 綜上所述,我們的工作將為天然產(chǎn)物抗HSV感染以及靶點研究提供新的思路,為開發(fā)利用天然產(chǎn)物作為抗病毒前體藥物提供實驗基礎。
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373.11
【圖文】：

圖1.1. HCWE抑制HSV-2的感染Vero細胞用不同濃度的HCWE (45, 150, 450 ng/ml)預處理2h，同時用5 tiM的阿昔洛韋（ACV)處理相同時間作為陽性對照。細胞感染HSV-2 (M0I = 2) 48h后用MTT方法檢測細胞活力，測得的OD570值與未處理的對照組（Con)進行標準化后，得到不同處理組細胞相對活力，用以反映病毒感染情況（A)。在平行實驗中，收集不同處理組的細胞感染上清和細胞，用PFU方法檢測病毒感染性顆粒的產(chǎn)生。通過各組數(shù)據(jù)與未處理的感染組（HSV-2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析后，得到P值，其中*P<0.05, **P<0.01表示具有顯著性差異（B)。在時間點給藥實驗中，用450 ng/ml濃度的HCWE在HSV-2感染之前2 h (-2h),感染的同時（Oh)或者感染后2 h、6 h、12 h處理Vero細胞，在病毒感染48 h后，用MTT方法檢測細胞活力，并根據(jù)公式計算HCWE在不同時間處理對HSV-2感染的抑制率（C)。Fig. 1.1. Inhibition of HSV-2 infection by Houttuynia cordata water extract. Dose responseof HCWE on HSV-2 infection. (A) Monolayers of Vero cells in 96-well plates were infectedwith HSV-2 at an MOI of 2 in the presence or absence of HCWE at 45，150，450 ng/ml.HSV-2 infection caused cytolytic effect. At 48 h post-infection (PI), cells that remained15

出[3細胞用450^18/1111的日%￡處理211后，感染 HSV-2 (M0I = 5) 6h、12 h、24 h后，收集細胞進行核蛋白提取，并用免疫印跡檢測p65蛋白的進核情況，Lamin B作為核蛋白的內(nèi)參，條帶相對灰度值是用軟件測得條帶的灰度值后與未處理的對照組進行比較獲得（A)。HeLa細胞用450陽/ml的HCWE處理2h后，感染HSV-2 (MOI =5)12h后，用免疫焚光觀察p65蛋白的胞內(nèi)定位情況，同時用TNFa刺激細胞30 min以誘導p65進核作為陽性對照（B)。Vero細胞用lOgM姜黃素（Cur)或450 ^xg/ml的HCWE預處理2 h，感染病毒24 h后獲取細胞總蛋白，用免疫印跡檢測HSV-2蛋白ICPO的表達情況以及NF-kB抑制蛋白IkBcx的降解情況（C)。另外，10|iM姜黃素（Cur)或450 pg/ml的HCWE預處理HeLa細胞2h后，用1 ng/ml的TNFa刺激細胞30 min，獲取細胞總蛋白檢測細胞中IicBa蛋白的降解情況（D)，GAPDH作為內(nèi)參對照。Fig. 1.2. HSV-2 infection induces NF-kB activation and HCWE treatment blocks NF-kBactivation. HeLa cells were infected with HSV-2 (MOI = 5) in the presence or absence of 450^ig/ml HCWE for 6, 12 and 24 h. NF-KB/p65 nuclear translocation was determined by proteinfractionation followed by immunoblotting with anti-p65 antibody. HSV-2 infection inducedpersistent NF-KB/p65 protein nuclear translocation, while treatment with HCWE blockedNF-KB/p65 activation induced by HSV-2 infection (A). The numbers represent relativeintensity of a p65 protein band to Lamin B, a loading control, in each sample compared tountreated and uninfected control. (B) Immunofluorescence assay also showed that HCWE

【共引文獻】

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本文編號：2732392