【摘要】：單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)是引起人類(lèi)皮膚性疾病的常見(jiàn)病原體。人類(lèi)是HSV感染的唯一宿主。HSV主要感染人類(lèi)面部以及生殖器部位的皮膚和黏膜,能引起口唇皰疹、口腔黏膜炎、角膜炎、生殖器皰疹甚至皰疹性腦炎等。另外,研究證實(shí)HSV感染與流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎、死胎、新生兒感染以及宮頸癌、阿爾茨海默等多種疾病密切相關(guān)。HSV是一種具有囊膜結(jié)構(gòu)的線性雙鏈DNA病毒。根據(jù)血清型不同,HSV可分為Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1和HSV-2)。據(jù)統(tǒng)計(jì),成人HSV-1血清抗體陽(yáng)性率高達(dá)90%。另外,HSV-2感染導(dǎo)致的生殖器皰疹不僅是一種性傳播疾病(sexually transmitted disease, STD),并且其感染還能顯著增加艾滋病病原體HIV (human immunodeficiency virus)的傳播。HSV具有裂解性感染和潛伏感染兩種方式。當(dāng)裂解性感染癥狀消退后,部分病毒沿軸突上行至神經(jīng)節(jié)并建立潛伏感染,并能逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)。當(dāng)機(jī)體免疫功能低下或受到外界壓力時(shí),潛伏感染的病毒被激活導(dǎo)致復(fù)發(fā)。 目前沒(méi)有可用于防治HSV的疫苗,臨床治療HSV感染的藥物主要為核苷類(lèi)似物,包括阿昔洛韋及其衍生物泛昔洛韋等。雖然這些核苷類(lèi)似物能特異性阻斷病毒DNA復(fù)制過(guò)程,但是也存在很多缺陷,例如靶點(diǎn)單一,生物利用度低,半衰期短以及嚴(yán)重的副反應(yīng)等。另外,這些藥物不能防止病毒的潛伏感染和復(fù)發(fā)頻率,對(duì)于突變株病毒的感染,這些核苷類(lèi)似物將會(huì)完全失效。因此尋找作用廣泛、毒副作用小的抗HSV藥物十分重要。 天然產(chǎn)物來(lái)源廣泛,并且具有簡(jiǎn)便易得、低毒等特點(diǎn)。因此,天然產(chǎn)物是尋找抗病毒活性成分的重要資源。目前,對(duì)于天然產(chǎn)物特別是植物提取物抗病毒的研究很多,但是大多停留在簡(jiǎn)單篩選水平。本研究旨從天然產(chǎn)物包括中草藥以及植物代謝產(chǎn)物中篩選具有抑制HSV感染的候選藥物,并進(jìn)一步尋找抗病毒活性化合物,研究抗病毒感染作用機(jī)理,為有效開(kāi)發(fā)利用天然產(chǎn)物作為抗病毒先導(dǎo)化合物和抗病毒藥物提供基礎(chǔ)。 我們從中國(guó)傳統(tǒng)中草藥中篩選到藥食兩用的魚(yú)腥草植物水提物(water extract of Houttuynia cordata, HCWE)具有顯著抗HSV感染作用,其半數(shù)抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration, IC50)為50μg/ml。NF-κB (nuclear factor-κB)作為HSV病毒復(fù)制過(guò)程中所需的轉(zhuǎn)錄因子,抑制其轉(zhuǎn)錄活化,能夠抑制病毒的感染。通過(guò)核漿蛋白分離實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),HSV-2感染6小時(shí)開(kāi)始明顯誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化進(jìn)核,HCWE處理組能顯著抑制病毒感染誘導(dǎo)的NF-κB的活化。免疫熒光、免疫印跡以及PFU (plaque forming unit)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HCWE特異性抑制病毒感染過(guò)程中NF-κB的活化,而不影響病毒感染誘導(dǎo)的MAPKs (mitogen-activated protein kinase)通路的活化,從而降低感染性病毒顆粒的產(chǎn)生和病毒蛋白的表達(dá)。通過(guò)HPLC (high performance liquid chromatography)化學(xué)分析,我們進(jìn)一步鑒定出水提物中的主要黃酮類(lèi)化合物槲皮素、槲皮苷以及異槲皮苷可能為抑制HSV感染的有效活性成分。 另外,多酚類(lèi)化合物白藜蘆醇和其寡聚體廣泛分布于植物中,是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物,具有廣泛的生物功能。我們篩選了32種從植物中分離鑒定出的白藜蘆醇衍生物的抗病毒活性,并發(fā)現(xiàn)10種白藜蘆醇寡聚體具有顯著抑制HSV-1和HSV-2感染作用。其抑制HSV-2的IC50均低于5μM。利用流式細(xì)胞術(shù)方法,我們檢測(cè)到白藜蘆醇寡聚體能顯著性地短暫誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生。通過(guò)添加活性氧的清除劑NAC (N-acetylcysteine)能有效逆轉(zhuǎn)化合物的抗病毒感染作用。這些結(jié)果說(shuō)明,化合物能夠通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS,從而抑制HSV的感染。這也預(yù)示著ROS可能作為信號(hào)分子在抗病毒感染過(guò)程中發(fā)揮積極作用。但是化合物通過(guò)何種途徑誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生以及ROS在抗病毒感染過(guò)程中的具體作用還需要進(jìn)一步研究。 綜上所述,我們的工作將為天然產(chǎn)物抗HSV感染以及靶點(diǎn)研究提供新的思路,為開(kāi)發(fā)利用天然產(chǎn)物作為抗病毒前體藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R373.11
【圖文】：

圖1.1. HCWE抑制HSV-2的感染Vero細(xì)胞用不同濃度的HCWE (45, 150, 450 ng/ml)預(yù)處理2h，同時(shí)用5 tiM的阿昔洛韋（ACV)處理相同時(shí)間作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞感染HSV-2 (M0I = 2) 48h后用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力，測(cè)得的OD570值與未處理的對(duì)照組（Con)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，得到不同處理組細(xì)胞相對(duì)活力，用以反映病毒感染情況（A)。在平行實(shí)驗(yàn)中，收集不同處理組的細(xì)胞感染上清和細(xì)胞，用PFU方法檢測(cè)病毒感染性顆粒的產(chǎn)生。通過(guò)各組數(shù)據(jù)與未處理的感染組（HSV-2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析后，得到P值，其中*P<0.05, **P<0.01表示具有顯著性差異（B)。在時(shí)間點(diǎn)給藥實(shí)驗(yàn)中，用450 ng/ml濃度的HCWE在HSV-2感染之前2 h (-2h),感染的同時(shí)（Oh)或者感染后2 h、6 h、12 h處理Vero細(xì)胞，在病毒感染48 h后，用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力，并根據(jù)公式計(jì)算HCWE在不同時(shí)間處理對(duì)HSV-2感染的抑制率（C)。Fig. 1.1. Inhibition of HSV-2 infection by Houttuynia cordata water extract. Dose responseof HCWE on HSV-2 infection. (A) Monolayers of Vero cells in 96-well plates were infectedwith HSV-2 at an MOI of 2 in the presence or absence of HCWE at 45，150，450 ng/ml.HSV-2 infection caused cytolytic effect. At 48 h post-infection (PI), cells that remained15

出[3細(xì)胞用450^18/1111的日%￡處理211后，感染 HSV-2 (M0I = 5) 6h、12 h、24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行核蛋白提取，并用免疫印跡檢測(cè)p65蛋白的進(jìn)核情況，Lamin B作為核蛋白的內(nèi)參，條帶相對(duì)灰度值是用軟件測(cè)得條帶的灰度值后與未處理的對(duì)照組進(jìn)行比較獲得（A)。HeLa細(xì)胞用450陽(yáng)/ml的HCWE處理2h后，感染HSV-2 (MOI =5)12h后，用免疫焚光觀察p65蛋白的胞內(nèi)定位情況，同時(shí)用TNFa刺激細(xì)胞30 min以誘導(dǎo)p65進(jìn)核作為陽(yáng)性對(duì)照（B)。Vero細(xì)胞用lOgM姜黃素（Cur)或450 ^xg/ml的HCWE預(yù)處理2 h，感染病毒24 h后獲取細(xì)胞總蛋白，用免疫印跡檢測(cè)HSV-2蛋白ICPO的表達(dá)情況以及NF-kB抑制蛋白IkBcx的降解情況（C)。另外，10|iM姜黃素（Cur)或450 pg/ml的HCWE預(yù)處理HeLa細(xì)胞2h后，用1 ng/ml的TNFa刺激細(xì)胞30 min，獲取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)細(xì)胞中IicBa蛋白的降解情況（D)，GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。Fig. 1.2. HSV-2 infection induces NF-kB activation and HCWE treatment blocks NF-kBactivation. HeLa cells were infected with HSV-2 (MOI = 5) in the presence or absence of 450^ig/ml HCWE for 6, 12 and 24 h. NF-KB/p65 nuclear translocation was determined by proteinfractionation followed by immunoblotting with anti-p65 antibody. HSV-2 infection inducedpersistent NF-KB/p65 protein nuclear translocation, while treatment with HCWE blockedNF-KB/p65 activation induced by HSV-2 infection (A). The numbers represent relativeintensity of a p65 protein band to Lamin B, a loading control, in each sample compared tountreated and uninfected control. (B) Immunofluorescence assay also showed that HCWE

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2732392