【摘要】：凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)是氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)的主要受體,分子量約為50 kDa的II型膜蛋白,屬于C型凝集素家族。LOX-1胞外結(jié)構(gòu)域(LOX-1 extracellular domain,LOX-1 ECD)被蛋白酶水解并釋放到血液中形成可溶性LOX-1(soluble LOX-1,sLOX-1)。LOX-1是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)及As相關(guān)疾病的新型潛在藥物靶點(diǎn)。此外,通過LOX-1的靶向成像可實(shí)現(xiàn)動脈硬化斑塊的定位和危險(xiǎn)分層。因此,以LOX-1為靶點(diǎn)的抗體研發(fā)對于動脈硬化治療具有重要意義。尤其是人源抗體在臨床診斷和治療中更加安全、有效,是抗體研究的熱點(diǎn)。然而,目前所報(bào)道的LOX-1抗體多為動物來源,人源抗體的研究報(bào)道極少。噬菌體展示技術(shù)避免了雜交瘤技術(shù)所必需的動物免疫過程,是體外獲得人源抗體的重要手段。它的最大優(yōu)勢是可直接將抗體片段展示于噬菌體表面并與內(nèi)部包裹的基因信息建立物理連接,便于操作。不同于完整免疫球蛋白分子,單鏈抗體(single chain variable fragment,scFv)是由重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL經(jīng)由一段氨基酸肽段(Linker)連接而成的基因工程小分子抗體。scFv分子量小,免疫原性小,且在組織和腫瘤的滲透性強(qiáng),在動脈硬化斑塊的成像、治療上具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢。本文為獲得抗LOX-1全人源scFv,構(gòu)建了庫容量為6.2×108的人源scFv噬菌體展示文庫,并從中篩選獲得了一株親和常數(shù)為5.8×10-6 M的單鏈抗體scFv-39,本研究為以LOX-1人源抗體為核心的治療動脈粥樣硬化藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。首先,本研究采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功地實(shí)現(xiàn)了 LOX-1 ECD蛋白的大量可溶性表達(dá),并采用MBP親和層析和分子篩純化方法獲得了純化的LOX-1 ECD。通過對宿主細(xì)胞和促溶標(biāo)簽的系統(tǒng)性優(yōu)化,結(jié)果表明在宿主細(xì)胞Rosetta gami2(DE3)中,LOX-1 ECD與MBP標(biāo)簽融合表達(dá)時(shí),融合蛋白的可溶性表達(dá)產(chǎn)量最高。通過表達(dá)條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn),MBP-LOX-1 ECD融合蛋白在30℃條件下培養(yǎng),采用200 μM的IPTG誘導(dǎo),蛋白的可溶性表達(dá)產(chǎn)量最高。本文通過MBP親和層析和分子篩的純化,獲得了純化的融合蛋白MBP-LOX-IECD。采用濃度為2.5 U/mg的凝血酶作用于MBP和LOX-1 ECD蛋白之間的氨基酸識別位點(diǎn),有效地去除融合蛋白中的MBP標(biāo)簽。再通過MBP親和層析和分子篩結(jié)合的純化方法獲得了純度為95%的LOX-1 ECD蛋白,并具有較高的oxLDL結(jié)合活性。其次,采用分子生物學(xué)和基因工程的方法構(gòu)建了一個(gè)容量為6.2×108人源scFv噬菌體展示文庫。本文分離20名心血管病人PBMC(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用半巢式PCR方法擴(kuò)增重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)Vλ/Vκ基因片段,并通過重疊延伸PCR方法分別將VH和Vλ/κ拼接為scFv。采用基因工程方法連接scFv至噬菌體展示系統(tǒng)的噬菌粒載體,并將重組載體電轉(zhuǎn)化進(jìn)入TG1細(xì)胞,構(gòu)建了人源scFv噬菌體展示系統(tǒng),并對文庫的陽性率和多樣性進(jìn)行了鑒定。然后本實(shí)驗(yàn)以LOX-1 ECD為抗原,從自構(gòu)建的人源scFv噬菌體展示文庫中篩選陽性重組噬菌體。采用固相淘篩方法,首先以免疫管為固相基質(zhì),進(jìn)行了3輪淘篩,并采用噬菌斑計(jì)數(shù)方法鑒定每輪淘篩的文庫輸入量和輸出量。同時(shí)采用多克隆噬菌體ELISA方法鑒定噬菌體與抗原特異性結(jié)合信號值的變化。結(jié)果表明,通過3輪淘篩,文庫中抗LOX-1ECD特異性重組噬菌體得到了有效富集。采用單克隆噬菌體ELISA方法,從富集后的噬菌體中隨機(jī)挑選了 40個(gè)單克隆進(jìn)行陽性克隆的篩選并獲得了 10株陽性克隆。最后本研究采用生物信息學(xué)方法對陽性克隆scFv-39序列進(jìn)行了分析,并對其進(jìn)行克隆和可溶性表達(dá)及親和力活性測定。通過IMGT數(shù)據(jù)庫工具對scFv-39序列進(jìn)行分析,確定scFv序列具有人源VH和VL區(qū)序列的基因特征,并確定了 CDRs區(qū)域。此外,分別采用ExPAsy數(shù)據(jù)庫的SOPMA工具、GENETYX軟件對scFv-39的二級結(jié)構(gòu)特征、物理性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。scFv-39共有735個(gè)堿基,編碼245個(gè)氨基酸序列。scFv-39平均分子量大小為26209.7 Da,等電點(diǎn)為8.98。采用短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了 scFv-39的可溶性分泌表達(dá),并在scFv-39的C-端引入6×His標(biāo)簽,采用鎳柱親和層析和分子篩結(jié)合的方法獲得了純化的scFv-39。采用間接ELISA方法測定scFv-39的親和常數(shù)為5.8×10-6M。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

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8 ;Recombinant scFv Antibodies against E Protein and N Protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Virus[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年08期

9 楊章民,司履生,王一理,來寶長;DESIGN OF ANTI-CD3 ScFv-B7.1 FUSION MOLECULE AND PREDICTION OF ITS BIOLOGICAL CHARACTERISTICS[J];Academic Journal of Xi'an Jiaotong University;2002年02期

10 ;Expression and bioactivity identification of soluble MG_7 scFv[J];World Journal of Gastroenterology;2002年01期

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本文編號：2731454