【摘要】：研究背景:登革病毒(Dengue virus,DENV)感染可以導(dǎo)致登革熱。由于DENV致病機制尚不完全清楚,延緩了治療方法的開發(fā)。目前尚未批準(zhǔn)任何特異性抗DENV藥物應(yīng)用于臨床,已有的抗其它病毒藥物抗DENV的效果不理想。因此尋找新的抗DENV策略是非常必要的。有研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞被DENV感染以前預(yù)先用干擾素處理,可以有效抑制DENV感染及病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制;但是在細(xì)胞被DENV感染以后再加入干擾素則不能發(fā)揮抗病毒作用,提示DENV感染導(dǎo)致病毒耐受干擾素,但具體的機制尚不清楚。同時有研究顯示,在DENV感染的患者外周血單核細(xì)胞和DENV感染的體外細(xì)胞模型中,泛素特異性蛋白酶18(USP18)的表達水平顯著升高。USP18是I型干擾素信號傳導(dǎo)通路負(fù)調(diào)控因子,它通過與干擾素受體亞基(IFNAR2)結(jié)合,抑制干擾素誘導(dǎo)的Jak/STAT信號通路的傳導(dǎo)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),在對干擾素治療不敏感(治療無效)的丙肝病毒感染者治療前肝組織內(nèi)USP18表達水平明顯升高;抑制USP18表達顯著增強干擾素抗HCV活性,提示USP18在HCV耐受干擾素中發(fā)揮非常重要的作用。USP18對DENV復(fù)制是否有影響以及與DENV拮抗I型干擾素抗病毒活性(耐受干擾素)是否存在關(guān)聯(lián),目前尚不清楚。研究目的:1.研究USP18對DENV-2復(fù)制的影響及其機制2.研究USP18在DENV-2耐受干擾素中的作用及機制研究內(nèi)容及方法:1.通過DENV-2感染Hela細(xì)胞,干擾素受體缺失的U5A細(xì)胞及其母細(xì)2fTGH,檢測細(xì)胞內(nèi)USP18的表達,明確DENV-2感染誘導(dǎo)USP18的表達是否依賴內(nèi)源性干擾素的激活;2.通過在Hela細(xì)胞中高轉(zhuǎn)USP18或通過siUSP18抑制USP18的表達,再感染DENV-2,檢測USP 18對DENV-2復(fù)制的影響;3.Hela,2fTGH和U5A細(xì)胞轉(zhuǎn)染siUSP18,感染DENV-2后加入IFNα,檢測敲低USP18后IFNα對DENV-2復(fù)制的影響;4.Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染siUSP18,感染DENV-2后加入IFNα,通過Western blot檢測Jak/STAT信號通路中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子(STAT1)的磷酸化水平;通過雙熒光報告基因檢測干擾素刺激反應(yīng)原件(ISRE)活性的變化;并通過實時熒光定量PCR對干擾素刺激基因(ISG)的表達水平進行檢測;5.構(gòu)建表達DENV-2病毒蛋白的質(zhì)粒并在293T細(xì)胞中高表達,通過免疫共沉淀法篩選與USP18相互作用的病毒蛋白。研究結(jié)果:1.DENV-2感染Hela,2fTGH和U5A細(xì)胞后均能誘導(dǎo)USP18表達,提示DENV-2誘導(dǎo)USP18表達不完全依賴干擾素的激活;2.在Hela細(xì)胞中高表達USP18促進DENV-2復(fù)制,敲低USP18抑制DENV-2復(fù)制;3.敲低USP18的Hela和2fTGH細(xì)胞感染DENV-2后加入IFNα,IFNα可以抑制DENV-2的復(fù)制;4.敲低USP18可以促進STAT1的磷酸化、增強ISRE活性、刺激ISGs的產(chǎn)生;5.USP18與DENV-2的E、NSI和NS3蛋白存在相互作用。研究結(jié)論:研究結(jié)果表明USP18在DENV-2感染及干擾素耐受中起著重要作用。DENV-2感染誘導(dǎo)USP18的表達,可以不依賴內(nèi)源性IFN-I介導(dǎo)的Jak/STAT信號通路。高表達USP 18可以促進DENV-2復(fù)制,敲低USP 18抑制DENV-2復(fù)制。USP 18高表達拮抗IFNα的抗DENV-2活性,導(dǎo)致病毒耐受干擾素;敲低USP18的表達通過激活Jak/STAT信號通路營救IFNα抗DENV-2的活性。同時,USP18與病毒蛋白E、NS1、NS3存在相互作用,USP18可能通過與病毒蛋白相互作用調(diào)控病毒復(fù)制,具體的機制還需要進一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R373
【圖文】：

１．１邋ＤＥＮＶ－２邋的制備逡逑Ｃ６／３６細(xì)胞培養(yǎng)在１０邋ｃｍ平皿中，待細(xì)胞長到５０％時加入５００邋ｊｘＬＤＥＮＶ－２原液，逡逑每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞病變效應(yīng)逐漸顯著。如圖１所示，待細(xì)胞病變達到９０％時，逡逑將培養(yǎng)皿放在－２０°Ｃ和３７。（：凍融一次后，離心收集細(xì)胞上清液，ＴＣＩＤ５０法檢測己經(jīng)逡逑擴X椀模模牛危鄭駁味�。辶x希危懼鍉|Ｖ：；＇＇逡逑；邋＇邋＇邋＼邋二、逡逑圖１邋ＤＥＮＶ－２感染后細(xì)胞病變圖逡逑（Ａ）正常Ｃ６／３６細(xì)胞；（Ｂ）邋ＤＥＮＶ－２感染５天后Ｃ６／３６細(xì)胞逡逑１．２邋ＤＥＮＶ－２滴度的測定逡逑將Ｃ６／３６細(xì)胞以１０４個細(xì)胞／孔的密度鋪在９６孔板中。病毒液用ＲＰＭＩ－１６４０培逡逑養(yǎng)基以１０倍連續(xù)稀釋的方法從１０－１稀釋到ｌ0－１Ｇ，每孔接種１００邋＾Ｌ，設(shè)正常細(xì)胞為逡逑３９逡逑

將ＤＥＮＶ－２以ＭＯＩ＝ｌ分別感染Ｈｅｌａ細(xì)胞、Ｖｅｒｏ細(xì)胞、Ｈｕｈ７．０細(xì)胞、Ｈｕｈ７．５．１逡逑細(xì)胞、２ｆＴＧＨ細(xì)胞和Ｕ５Ａ細(xì)胞，，在不同的時間點收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)ＤＥＮＶ－２逡逑ＲＮＡ水平。結(jié)果如圖２所示，ＤＥＮＶ－２成功感染Ｈｅｌａ細(xì)胞（圖２Ａ），Ｖｅｒｏ細(xì)胞（圖逡逑２Ｂ），Ｈｕｈ７＿５．１邋細(xì)胞（圖邋２Ｃ），邋Ｈｕｈ７．０邋細(xì)胞（圖邋２Ｄ），邋２ｆＴＧＨ邋細(xì)胞（圖邋２Ｅ）和邋Ｕ５Ａ逡逑細(xì)胞（圖２Ｆ），并且隨著時間的推移，ＤＥＮＶ－２ＲＮＡ逐漸上升，表明ＤＥＮＶ－２能在逡逑這些細(xì)胞系中復(fù)制增殖。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ＤＥＮＷＩＩｅｌａ邐ＤＦＮＶＡ，ｅｒｏ逡逑１２０００００．０－１邋２００００－逡逑＾邋＝邋．00000．0■邐，邐＊邋Ｉ邋１５０００－邐ｊｌ逡逑Ｉ邋＾邋Ｉ邋？00000．0？邐．１邋＜邋＜邋１００００＇逡逑ｌｉｅ逡逑ｌｉｉ邋８0ｏｔ邋／邐５邐／逡逑ｓｉ邋ｓ／邐ｍＶ逡逑０邐２４邐＜３邐７２邐９６邐０邐１２邐２４邐３６邐４８邐ＳＯ邋７２逡逑ＴｉｎＫ？0Ｓｌ－ｔ，－？ｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋Ｃｈｒｓ）邐Ｔｉｍｅ邋ｐｏｓｔ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｆｈｒ？）逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑ＤＫＮＶ７Ｈ？ｈ７．５．Ｉ邐Ｕ邐訛ＮＶ／Ｉ邋媝逡逑１００００－１邐１０００－，邐，逡逑ｉ邋ｉ邋ｒ：邐ｊ邋ｉ邋￥ｚ邐７逡逑１１１邐［１３邋２

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊思齊;登革熱與登革出血熱的治療[J];人民軍醫(yī);1995年04期

本文編號：2729187