【摘要】：目的：探討鐵離子（Ferric ion）在破骨細(xì)胞分化過程以及骨吸收中的作用，同時闡述其中可能存在的機(jī)理，以進(jìn)一步闡明鐵代謝與骨代謝之間的關(guān)系。 方法：1.以RAW264.7作為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，以枸櫞酸鐵銨（ferric ammoniumcitrate, FAC）作為三價鐵離子供體，首先研究12uM、25uM、50uM、100uM、200uMFAC對RAW264.7增值活力的影響。2.在20ng/ml核因子κB受體活化因子配體（RANKL）存在下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)1結(jié)果選取12uM、25uM、50uM FAC干預(yù)RAW264.7，抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）觀察TRAP陽性細(xì)胞形成情況并計(jì)數(shù)（以細(xì)胞核≥3個為TRAP陽性細(xì)胞，即破骨細(xì)胞）。3.以2,7-DCF-DA作為細(xì)胞內(nèi)熒光探針，流式細(xì)胞儀檢測不同濃度FAC以及FAC聯(lián)合RANKL干預(yù)RAW264.7后細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species/ROS）水平。4.檢測FAC聯(lián)合RANKL干預(yù)后破骨細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量，以及還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值（GSH/GSSG）。5.利用N-乙酰-半胱氨酸（NAC）作為抗氧化劑，觀察FAC聯(lián)合NAC干預(yù)后對破骨細(xì)胞形成的影響。6.分別用RT-PCR、Western blot檢測FAC以及FAC+NAC干預(yù)RAW264.7后TRAP、Cathepsin-K、NFATc1表達(dá)變化情況。7.選取24只雄性ICR小鼠，隨機(jī)分為3組，分別腹腔注射生理鹽水、FAC、FAC+NAC，建立對照組、高鐵組、高鐵+抗氧化劑組小鼠模型。干預(yù)完成后取小鼠骨髓源性單核細(xì)胞進(jìn)行破骨細(xì)胞培養(yǎng)，觀察不同組別破骨細(xì)胞形成情況。8.取各組小鼠股骨進(jìn)行HE染色觀察骨小梁情況。9.用Miro-CT對各組小鼠股骨遠(yuǎn)端及股骨中段進(jìn)行掃描，并進(jìn)行三維圖像重建，分析各參數(shù)值。10.留取各小鼠血清，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中鐵蛋白（Ferritin）、丙二醛（MDA）、8-羥基-鳥苷（8-OH-DG）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRAP-5b）、一型膠原C端肽（CTX）、核因子κB受體活化因子配體/骨保護(hù)素（RANKL/OPG）、骨堿性磷酸酶（BALP）、骨鈣素（BGP）水平。 結(jié)果：1.12uM、25uM、50uM FAC對RAW264.7增值無抑制作用（P0.05），100uM、200uM FAC對RAW264.7有抑制作用（P0.05）。2. FAC能在一定范圍內(nèi)（0uM、12uM、25uM、50uM）促進(jìn)破骨細(xì)胞（TRAP陽性細(xì)胞）形成（P0.05）。3. FAC能在一定范圍內(nèi)提高細(xì)胞內(nèi)活性氧，同時FAC和RANKL聯(lián)合干預(yù)也能提高RAW264.7細(xì)胞內(nèi)活性氧水平（P0.05）。4. FAC聯(lián)合RANKL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量下降（P0.05），GSH/GSSG上升（P 0.05）。5.抗氧化劑NAC能部分抑制FAC對破骨細(xì)胞形成的促進(jìn)作用（P 0.05）。6. RT-PCR、Westernblot結(jié)果提示FAC能上調(diào)TRAP、Cathepsin-K、NFATc1的表達(dá)（P0.05），NAC能部分抑制FAC介導(dǎo)的這一作用（P 0.05）。7.利用動物模型骨髓源性單核細(xì)胞培養(yǎng)破骨細(xì)胞結(jié)果提示，高鐵組動物模型骨髓源性單核細(xì)胞形成的破骨細(xì)胞顯著多于正常對照組（P 0.05），而鐵離子和NAC聯(lián)合干預(yù)組形成的破骨細(xì)胞少于高鐵組（P0.05）。8.高鐵組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁較對照組稀疏，而NAC和鐵離子聯(lián)合干預(yù)組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁密度高于高鐵組。9. Micro-CT對小鼠股骨遠(yuǎn)端分析結(jié)果提示，高鐵組小鼠股骨遠(yuǎn)端微觀結(jié)構(gòu)較對照組退變明顯，而NAC與鐵離子聯(lián)合干預(yù)組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨微觀結(jié)構(gòu)退變較輕。10.高鐵組小鼠血清中Ferritin、MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG顯著高于對照組（P0.05），而NAC和鐵離子聯(lián)合干預(yù)組MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG顯著低于高鐵組（P0.05）；相反，高鐵組小鼠血清中BALP、BGP含量明顯低于對照組（P0.05），而鐵離子和NAC聯(lián)合干預(yù)組血清中BALP、BGP含量顯著高于高鐵組（P 0.05）。 結(jié)論：鐵離子能促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，同時能在體內(nèi)增強(qiáng)骨吸收；這一作用可能與鐵離子能促進(jìn)活性氧形成，提高體內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān)。鐵離子對骨吸收的促進(jìn)作用是其引起骨質(zhì)疏松的重要因素，抗氧化劑可能通過抑制鐵離子介導(dǎo)的骨吸收增強(qiáng)在鐵過載骨質(zhì)疏松防治方面起到一定的作用。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329
【圖文】：

數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 SPSS13.0 軟件統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗(yàn)，P 值< 0.05 為有統(tǒng)銨對 RAW264.7 細(xì)胞活性的影響果提示，與對照組即 0uM FAC 干預(yù)組相比，12、長活性基本無影響，即既不會促進(jìn)細(xì)胞增殖，也不00uM 開始，F(xiàn)AC 開始對 RAW264.7 細(xì)胞生長起抑們在接下來的實(shí)驗(yàn)中選取 12、25、50uM FAC 干預(yù)破骨細(xì)胞形成的影響，從而排除了鐵離子對破響。

在培養(yǎng)基中加入 RANKL 誘導(dǎo) RAW264.7 向破骨細(xì)胞分化。約 2-3 天單核融合，有體積稍大的破骨細(xì)胞形成。約 4-6 天后可見光鏡下可見較大的破成，其體積是正常 RAW264.7 細(xì)胞的數(shù)十倍，甚至上百倍、上千倍，破骨各異，可為圓形、橢圓形、香蕉形等。因?yàn)槠乒羌?xì)胞實(shí)質(zhì)上是單核細(xì)胞融所以破骨細(xì)胞的形狀取決于參與融合的單核細(xì)胞中外圍單核細(xì)胞所形成另外破骨細(xì)胞細(xì)胞核常大于等于 3 個，且細(xì)胞核較大，光鏡下折光性強(qiáng)。加誘導(dǎo)劑的 RAW264.7 細(xì)胞，細(xì)胞較小，呈梭形，圖 2B 中紅色箭頭所指的較大的破骨細(xì)胞。培養(yǎng)完成后細(xì)胞經(jīng)抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，如圖 2C 所示，KL 的 RAW264.7 的細(xì)胞無抗酒石酸酸性磷酸酶陽性細(xì)胞形成，細(xì)胞較小。而如圖 2D 所示體積巨大的染色為酒紅色的破骨細(xì)胞形成，且細(xì)胞核多即為抗酒石酸酸性磷酸酶陽性細(xì)胞。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2728915