【摘要】：第一部分 表皮干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定 目的體外分離培養(yǎng)表皮干細(xì)胞,并對所取表皮干細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué),特異標(biāo)志物進(jìn)行檢測,以確保所取細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。 方法根據(jù)之前研究者的體外培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞方法進(jìn)行綜合,并成功提取出表皮干細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng),選取表皮干細(xì)胞特定的表面標(biāo)記物CK19,整合素β1運(yùn)用免疫熒光染色鑒定,并對細(xì)胞進(jìn)行整合素a6和CD71雙染色通過流式細(xì)胞儀檢測,鑒定所取的細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。 結(jié)果根據(jù)倒置相差顯微鏡所得細(xì)胞形態(tài),免疫熒光檢測結(jié)果顯示所取細(xì)胞CK19及整合素p1陽性,及流式細(xì)胞儀檢測指標(biāo)結(jié)果所取細(xì)胞整合素a6陽性,CD71陰性。 結(jié)論體外成功分離培養(yǎng)出表皮干細(xì)胞。 第二部分 不同頻率低強(qiáng)度電磁場對表皮干細(xì)胞beta-catenin, Myc基因的影響 目的觀察表皮干細(xì)胞的增殖、分化相關(guān)基因myc, beta-catenin在低頻電磁場中的變化。 方法從大鼠背部皮膚處分離的第2代表皮干細(xì)胞(EpiSC)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,實(shí)驗(yàn)組又根據(jù)低強(qiáng)度磁場頻率不同分為15,50,75Hz組。將各組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,免疫熒光染色檢測,RT-PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)變化,免疫組化鑒定細(xì)胞的相關(guān)蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果表皮干細(xì)胞在受到低強(qiáng)度磁場刺激后myc,β-catenin與對照組比有顯著差異(P0.01),且不同頻率下存在差異,50Hz75Hz15Hz(P0.05)。 結(jié)論低強(qiáng)度脈沖電磁場能促進(jìn)表皮干細(xì)胞分化,不同頻率刺激效果不同。 第三部分 Nanog和β-catenin對表皮干細(xì)胞增殖、分化中新的調(diào)控點(diǎn) 目的明確在表皮干細(xì)胞的增殖和分化的過程中Nanog通路和wnt/β-catenin通路是否存在內(nèi)在聯(lián)系。 方法本實(shí)驗(yàn)從大鼠背部皮膚處分離的第2代表皮干細(xì)胞(EpiSC)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,將各組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,免疫熒光染色檢測,用MTT法測定表皮干細(xì)胞的增殖,免疫組化鑒定細(xì)胞的相關(guān)蛋白整合素β-1及CK15表達(dá)情況。Western Blotting、PCR測定β-catenin和Nanog含量水平的變化。 結(jié)果MTT法檢測到10-7M SP顯著促進(jìn)EpSCs的增殖,且EpSCs仍保持其干細(xì)胞性。Western Blotting檢測到β-catenin和Nanog蛋白在最初24小時少量表達(dá), Nanog蛋白水平在24h后顯著表達(dá)并持續(xù)72h,72h后明顯下降。而β-catenin蛋白水平在整個過程中持續(xù)升高。PCR檢測到Nanog mRNA在整個過程中表達(dá)降低,β-catenin mRNA和Myc mRNA在整個增殖過程中持續(xù)高表達(dá)。 結(jié)論實(shí)驗(yàn)表明10-7M神經(jīng)肽SP物質(zhì)可有效的刺激表皮干細(xì)胞的增殖,表明Nanog通路和wnt/β-catenin通路的可能存在聯(lián)系。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2728839