【摘要】：第一部分:轉(zhuǎn)化細胞生長因子β_3(TGF-β_3)基因重組腺病毒載體的構(gòu)建 目的將含轉(zhuǎn)化細胞生長因子β_3(Transforming Growth Factor beta3, TGF-β_3)基因的質(zhì)�？寺≈料俨《举|(zhì)粒載體中并導(dǎo)入包裝細胞,產(chǎn)生表達目的基因的重組腺病毒。 方法含有TGF-β_3的質(zhì)粒經(jīng)酶切、分離、純化并采用定向克隆的方法克隆進入穿梭質(zhì)pShuttle-EGFP中,獲得pShuttle-EGFP-TGFβ_3,與pAdxsi (腺病毒骨架質(zhì)粒)轉(zhuǎn)入細菌,得到TGF-β_3重組腺病毒質(zhì)粒,用脂質(zhì)體介導(dǎo)入HEK 293細胞,產(chǎn)生表達目的基因的重組腺病毒載體,用倍比稀釋方法測定重組腺病毒載體滴度。 結(jié)果⑴TGF-β_3基因克隆進入腺病毒質(zhì)粒載體中形成重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-EGFP-TGFβ_3 ;⑵重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-EGFP-TGFβ_3導(dǎo)入包裝細胞HEK 293中形成能表達TGF-β_3的重組腺病毒Ad-TGF-β_3;⑶倍比稀釋法測定獲得具有高滴度重組腺病毒Ad-TGF-β_3。 結(jié)論TGF-β_3基因克隆至重組腺病毒中,成功構(gòu)建TGF-β_3基因重組腺病毒載體,為進一步研究TGF-β_3基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合殼聚糖支架打下了良好的基礎(chǔ)。 第二部分TGF-β_3基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)復(fù)合至殼聚糖支架的研究 目的⑴探討殼聚糖支架的制備方法。⑵將目的基因TGF-β_3轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)復(fù)合至殼聚糖支架觀察細胞的生長情況及目的基因的表達。 方法⑴利用冷凍干燥法制備殼聚糖支架。⑵密度梯度+貼壁法分離培養(yǎng)MSCs,將TGF-β_3轉(zhuǎn)染MSCs熒光顯微鏡觀察TGF-β_3轉(zhuǎn)染MSCs情況Western-Blot檢測TGF-β_3基因轉(zhuǎn)染MSCs的蛋白表達情況。⑶TGF-β_3轉(zhuǎn)染MSCs復(fù)合至殼聚糖支架,分別用MTT法和掃描電鏡法觀察細胞的生長粘附情況。 結(jié)果⑴2%(w/w)的殼聚糖溶液使用冷凍干燥法制得白色海綿狀殼聚糖支架。⑵分離培養(yǎng)的MSCs純度高,形態(tài)均勻,TGF-β_3轉(zhuǎn)染MSCs轉(zhuǎn)染效率高,Ad-TGF-β_3轉(zhuǎn)染MSCs后對細胞生長增殖無影響,Western-Blot可見轉(zhuǎn)染TGF-β_3的MSCs有陽性條帶出現(xiàn)。⑶Ad-TGF-β_3轉(zhuǎn)染MSCs復(fù)合至殼聚糖支架MSCs細胞生長粘附良好,Ad-TGF-β_3轉(zhuǎn)染MSCs對細胞在殼聚糖支架上的生長增殖無影響,Ad-TGF-β_3轉(zhuǎn)染MSCs復(fù)合至殼聚糖支架組較未復(fù)合殼聚糖支架組細胞生長增殖活性更好。 結(jié)論MSCs在殼聚糖支架上生長粘附良好,構(gòu)建的目的基因TGF-β_3轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)復(fù)合殼聚糖支架是理想的組織工程再生修復(fù)的載體。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329
【圖文】：

圖 1.3 pShuttle-EGFP-TGFβ3Fig1.3 pShuttle-EGFP-TGFβ33.1.2 重組穿梭質(zhì)粒的測序檢測測得的 pShuttle-EGFP-TGFβ3測序圖譜(圖 4)5kb1.5kb6kb10kb1kb1.2.3: pShuttle-EGFP-TGFβ3

圖 1.7 轉(zhuǎn)染前 293 細胞(倒置相差顯微鏡 ×100)Fig1.7 The extension dyes first 293 cell(inversion phase contrast microscope ×100)轉(zhuǎn)染第一天微鏡 ×100)y after transfertationtrast microscope ×100)圖 1.9 轉(zhuǎn)染第一(熒光顯微鏡Fig1.9 the 1th day a(fluorescence m

【參考文獻】

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本文編號：2728138