【摘要】：嗜鉻粒蛋白A(Chromogranin A,CgA)是一種可溶性神經(jīng)內(nèi)分泌酸性蛋白,分子量約為49 kDa。CgA廣泛存在于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中,主要由神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和其他組織內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)分泌。研究表明,在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中,CgA的表達(dá)含量明顯高于相應(yīng)的正常組織,因此,CgA成為臨床上神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤檢測(cè)的重要標(biāo)志物。研究和制備識(shí)別CgA特定表位的高親和力抗體可以為臨床診斷和科學(xué)研究提供有價(jià)值的服務(wù)。本研究將人CgA編碼基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,然后將優(yōu)化后的CgA基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a上。通過大腸桿菌BL21(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CgA融合蛋白,接著通過親和層析純化獲得CgA-His重組蛋白。將純化后的CgA-His6蛋白作為免疫原,免疫5周齡BALB/c小鼠,刺激小鼠產(chǎn)生CgA抗體。當(dāng)小鼠血清的抗體滴度超過1:8000時(shí),利用雜交瘤技術(shù)將小鼠B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合制備分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞;通過CgA抗原篩選,最終獲得一株穩(wěn)定分泌CgA抗體的細(xì)胞株4E5。通過實(shí)驗(yàn)鑒定,雜交瘤細(xì)胞株4E5的染色體數(shù)目為102±4,分泌的抗體類型為IgG2b。利用親和層析方法從接種過細(xì)胞株的小鼠腹水純化獲得CgA單克隆抗體,iELISA和Western blot實(shí)驗(yàn)表明4E5抗體具有很強(qiáng)的特異性。通過IHC實(shí)驗(yàn)分析表明,4E5抗體可以特異性識(shí)別非小細(xì)胞肺癌、胰島細(xì)胞癌以及腎上腺素組織中CgA的表達(dá),識(shí)別CgA的靈敏度比鼠抗LK2H10+PHE5和兔抗SP12的染色效果更好。對(duì)4E5抗體做進(jìn)一步鑒定,結(jié)果表明抗體效價(jià)為5.12×105,親和力為9.23×109L/mol。同時(shí)IHC實(shí)驗(yàn)表明,4E5抗體在4℃或37℃條件下處理50 d,仍具有很強(qiáng)的抗體活性,表明4E5抗體具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步研究4E5特異識(shí)別的序列,將CgA的編碼序列在大腸桿菌中進(jìn)行分段表達(dá),然后通過Western Blot方法與CgA的不同肽段進(jìn)行雜交。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4E5抗體特異識(shí)別CgA111-220肽段。本研究為設(shè)計(jì)生產(chǎn)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)并可用于IHC的CgA抗體提供了方法學(xué)參考,并且所獲得的CgA高親和力抗體和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將為臨床診斷提供有價(jià)值的選擇和參考。
【圖文】：

２．３．４．１目的蛋白的表達(dá)和純化逡逑ｐＥＴ２８ａ－Ｃ爐（Ａ＾ｏ＂ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株在ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)純化后，經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ逡逑分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ鑒定，結(jié)果如圖２－７。與１空載ｐＥＴ２８ａ的表達(dá)相比，重組載逡逑體２、３表達(dá)的蛋白與Ｍａｋｅｒ比對(duì)在７０邋ｋＤａ位置左右，有明顯的表達(dá)條帶，經(jīng)親逡逑和層析純化后目的蛋白５、６的大小與表達(dá)條帶大小一致，４為大量表達(dá)未純化逡逑前的上清總蛋白。逡逑ｋＤａ邋Ｍ邋１邐２邐３邐４邐５邐６逡逑１２０邋ｉ邋＿邋＇邐：．逡逑１邋00邐＜—：逡逑罰卜幽．ｖ：邋，邋’’胃逡逑：：ｒｏｐ逡逑圖２－７邋ＣｇＡ－Ｈｉｓ邋６融合蛋白的純化與鑒定，Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋ｐＥＴ２８ａ的空載蛋白；２，３：逡逑？￡丁２８３－（＾＾／五．如／／８１＾１（０￡３）蛋白；４：0３八－９＾６邋１１１８１＾１（０丑３）總蛋白；５

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【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 李佳;齊軍;;小細(xì)胞肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2015年12期

2 謝明;張丹;任國勝;;嗜鉻粒蛋白A及其衍生多肽在天然免疫系統(tǒng)中的作用[J];醫(yī)學(xué)綜述;2013年06期

3 張衛(wèi)琴;;免疫組化技術(shù)在病理診斷中的應(yīng)用[J];安徽醫(yī)藥;2012年11期

4 王紅群;王慶梅;蔣毅;湯e

本文編號(hào)：2700993