本文關(guān)鍵詞：抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶0TUD3轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及表型分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：PTEN是1997年新發(fā)現(xiàn)的定位在第10號(hào)染色體上的抑癌基因,經(jīng)過18年的研究發(fā)現(xiàn)它是在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中具有重要的抑癌作用。PTEN在腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中具有很高的突變率或低表達(dá)率,并且在Cowden綜合癥、Bannayan-Zonana綜合癥等腫瘤易感性疾病中也有很高的遺傳性突變。此外,PTEN基因雜合缺失的小鼠能自發(fā)形成乳腺癌、甲狀腺瘤、子宮內(nèi)膜瘤等多種腫瘤,并且PTEN基因純合缺失的小鼠也因細(xì)胞增殖過快而細(xì)胞程序性死亡不足在胚胎期9.5天出現(xiàn)死亡。最近對(duì)PTEN轉(zhuǎn)基因小鼠的研究還發(fā)現(xiàn),PTEN在小鼠體內(nèi)過表達(dá)后,小鼠對(duì)腫瘤抵抗能力增強(qiáng)。這些證據(jù)都表明:PTEN是一個(gè)重要的抑癌基因。PTEN在細(xì)胞內(nèi)既定位在細(xì)胞質(zhì),也定位在細(xì)胞核。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PTEN可以利用其脂質(zhì)磷酸酯酶活性,逆轉(zhuǎn)PI3K的磷酸化作用,抑制PI3K-Akt與m TOR信號(hào)通路,發(fā)揮抑癌功能;而在細(xì)胞核內(nèi),PTEN主要通過維持基因組穩(wěn)定性發(fā)揮抑癌功能。目前的研究發(fā)現(xiàn)PTEN對(duì)腫瘤發(fā)生的抑制作用與以往理解的“單倍劑量不足”理論不同,其蛋白水平的微量變化即與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。當(dāng)PTEN蛋白水平減少至80%時(shí),乳腺癌的發(fā)生率就高達(dá)40%,足以說明PTEN劑量變化對(duì)腫瘤易感性存在重要影響。雖然PTEN從轉(zhuǎn)錄到翻譯表達(dá)的過程中受到磷酸化、乙�；�、泛素化、類泛素化等多種修飾,但在細(xì)胞內(nèi),蛋白質(zhì)的穩(wěn)定依然主要由泛素化修飾調(diào)節(jié)。泛素化修飾在生物體內(nèi)是一個(gè)平衡的調(diào)節(jié)系統(tǒng),泛素化修飾與去泛素化修飾共同作用調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。目前發(fā)現(xiàn)的PTEN的泛素連接酶已有5個(gè)(NEDD4-1、WWP2、XIAP、CHIP、TRIM27/RFP),但直到我們開展篩選能調(diào)控PTEN蛋白穩(wěn)定性的去泛素化酶這個(gè)工作時(shí),能調(diào)控PTEN蛋白穩(wěn)定性的去泛素化酶依然未被揭示。我們通過對(duì)人類去泛素化酶庫(kù)中的接近90個(gè)去泛素化酶篩選后,發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了OTU家族的去泛素化酶OTUD3(OTU Domain Containing 3)是一個(gè)能夠去除PTEN泛素化,調(diào)節(jié)其蛋白穩(wěn)定性的去泛素化酶。并且,細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明OTUD3可以通過穩(wěn)定PTEN的蛋白水平抑制PI3K-Akt通路,抑制細(xì)胞增殖、遷移和成瘤能力。既然OTUD3在分子與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能夠利用其去泛素化酶活性,穩(wěn)定PTEN蛋白水平并發(fā)揮抑癌功能,那是否在生理?xiàng)l件下OTUD3也具有同樣的功能呢?圍繞著“在生理?xiàng)l件下OTUD3是否能穩(wěn)定PTEN并發(fā)揮抑癌功能”這一科學(xué)問題,我們利用基因工程技術(shù),采用能夠保護(hù)插入片段完整高效表達(dá)的人工細(xì)菌染色體(BAC)策略,構(gòu)建了OTUD3與PTEN轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并對(duì)表型進(jìn)行分析研究。通過分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維(MEF)細(xì)胞,對(duì)OTUD3與PTEN轉(zhuǎn)基因小鼠單獨(dú)建系并開展了一系列實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在OTUD3轉(zhuǎn)基因小鼠中,OTUD3與PTEN存在相互作用,PTEN蛋白水平顯著高于野生型小鼠,并且這一作用是通過去除PTEN的泛素化,穩(wěn)定其蛋白水平實(shí)現(xiàn)的。此外,我們利用MEF細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OTUD3在小鼠原代細(xì)胞中能夠通過穩(wěn)定PTEN蛋白水平參與抑制PI3K-Akt信號(hào)通路。在動(dòng)物的整體表型上,我們對(duì)這兩個(gè)小鼠模型的梯度表達(dá)系小鼠進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn):OTUD3轉(zhuǎn)基因小鼠與PTEN轉(zhuǎn)基因小鼠在體型上均小于野生型小鼠,并隨著OTUD3與PTEN表型量的增加而逐漸明顯。說明OTUD3在體內(nèi)過表達(dá)后,能使PTEN蛋白水平上升并發(fā)揮其在代謝上在體過表達(dá)后調(diào)控小鼠體型大小的功能。MMTV-Py V MT轉(zhuǎn)基因小鼠可以自發(fā)形成乳腺癌,是用于乳腺癌研究的經(jīng)典小鼠模型。為了在體內(nèi)研究OTUD3的抑癌功能,我們將OTUD3轉(zhuǎn)基因小鼠與MMTV-Py V MT轉(zhuǎn)基因小鼠交配構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠雙雜模型,跟蹤觀察OTUD3在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。研究發(fā)現(xiàn)OTUD3在體內(nèi)過表達(dá)后,不論是在腫瘤形成的時(shí)間上,還是數(shù)量與大小上,都對(duì)乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展具有顯著的抑制作用。從遺傳學(xué)上充分證明OTUD3是PTEN的一個(gè)重要的穩(wěn)定調(diào)控因子,在體內(nèi)OTUD3發(fā)揮著重要的抑癌功能。本文還探究了在不同的乳腺癌細(xì)胞系中OTUD3與PTEN蛋白水平的關(guān)系。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)在有PTEN表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系中,OTUD3的表達(dá)量與PTEN蛋白水平基本上是一致的,說明OTUD3對(duì)PTEN的調(diào)控作用是普遍存在的,而不是僅僅是在某些特定的乳腺癌細(xì)胞系中。此外,OTUD3在高轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞系中異常低表達(dá),提示OTUD3在乳腺癌中可能參與腫瘤的轉(zhuǎn)移或耐藥過程。本文通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)探討了OTUD3、USP13與PTEN在乳腺癌組織中蛋白水平的關(guān)系。結(jié)果顯示OTUD3與USP13在乳腺癌組織中對(duì)PTEN的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控上具有協(xié)同作用,當(dāng)二者在腫瘤組織中蛋白水平都低時(shí),PTEN的蛋白水平最低,反之亦然;而當(dāng)一高一低時(shí),PTEN蛋白處于中等水平。我們的研究通過利用OTUD3轉(zhuǎn)基因小鼠模型的MEF細(xì)胞證明了OTUD3在生理?xiàng)l件下可以通過去除PTEN的泛素化,穩(wěn)定PTEN的蛋白水平;而對(duì)OTUD3與PTEN轉(zhuǎn)基因小鼠整體表型的研究也表明:OTUD3通過穩(wěn)定PTEN蛋白水平,在轉(zhuǎn)基因小鼠整體上顯現(xiàn)出了與OTUD3相似的表型。同時(shí),通過引入MMTV-Py V MT乳腺癌自發(fā)小鼠模型構(gòu)建雙雜小鼠模型,驗(yàn)證了OTUD3可以通過調(diào)控PTEN的蛋白水平發(fā)揮抑癌功能。綜合這三點(diǎn),我們的研究為回答“OTUD3是否是PTEN真正的生理去泛素化酶?”這一科學(xué)問題提供了重要的遺傳學(xué)依據(jù)。此外,在乳腺癌細(xì)胞系中對(duì)OTUD3與PTEN蛋白水平關(guān)系的研究以及OTUD3、USP13、PTEN三者在乳腺癌組織中調(diào)控關(guān)系的研究也拓寬了我們對(duì)OTUD3作為抑癌基因發(fā)揮抑癌功能的認(rèn)識(shí)。
【關(guān)鍵詞】：PTEN 去泛素化酶 OTUD3轉(zhuǎn)基因小鼠 抑癌 乳腺癌
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.5;R-332
【目錄】：

• 縮略詞6-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 第一章 前言14-28
• 1．腫瘤危害現(xiàn)狀14
• 2. 抑癌蛋白PTEN的結(jié)構(gòu)與功能14-17
• 3. PTEN的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控17-23
• 3.1 轉(zhuǎn)錄與翻譯后調(diào)控17-19
• 3.2 泛素化修飾19-20
• 3.3 去泛素化修飾20-23
• 4. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備與應(yīng)用23-28
• 第二章 PTEN去泛素化酶OTUD3 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立28-40
• 1. 研究背景28-31
• 2. 材料與方法31-35
• 2.1 打靶載體31
• 2.2 抗體31
• 2.3 引物31
• 2.4 試劑31-32
• 2.5 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)溶液32
• 2.6 轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建、繁殖與鑒定32
• 2.7 MEF細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 2.8 小鼠組織蛋白提取34
• 2.9 Western blotting步驟34
• 2.10 統(tǒng)計(jì)方法34-35
• 3．結(jié)果35-38
• 3.1 OTUD3 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及繁殖鑒定35
• 3.2 OTUD3 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)OTUD3 蛋白過表達(dá)并穩(wěn)定PTEN蛋白水平35-38
• 4. 小結(jié)38
• 5. 討論38-40
• 第三章 OTUD3 調(diào)節(jié)小鼠體型大小40-48
• 1. 研究背景40-41
• 2. 材料與方法41
• 2.1 動(dòng)物41
• 2.2 引物41
• 2.3 試劑與方法41
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析41
• 3．結(jié)果41-46
• 3.1 PTEN轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及鑒定繁殖41-44
• 3.2 OTUD3 轉(zhuǎn)基因小鼠體型小于野生型小鼠44-46
• 4. 小結(jié)46
• 5. 討論46-48
• 第四章OTUD3 轉(zhuǎn)基因小鼠抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展48-54
• 1. 研究背景48-49
• 2. 材料與方法49-50
• 2.1 動(dòng)物49
• 2.2 引物49
• 2.3 試劑49
• 2.4 鼠尾基因組精提步驟49-50
• 2.5 乳腺整體染色50
• 3．結(jié)果50-53
• 3.1 OTUD3tg/-/PyVtg/-雙雜小鼠的獲得50-51
• 3.2 OTUD3tg/-/PyVtg/-小鼠抑制乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展51-53
• 4. 小結(jié)53
• 5. 討論53-54
• 第五章OTUD3 在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)研究54-61
• 1. 研究背景54
• 2. 材料方法54-55
• 2.1 細(xì)胞54-55
• 2.2 乳腺癌組織芯片55
• 2.3 抗體55
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)溶液及培養(yǎng)方法55
• 2.5 免疫組化55
• 2.6 數(shù)據(jù)分析55
• 3. 結(jié)果55-59
• OTUD3 在高轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)55-57
• 3.2 OTUD3 與USP13 協(xié)同調(diào)控PTEN的蛋白穩(wěn)定性并在乳腺癌組織中低表達(dá)57-59
• 4. 小結(jié)59
• 5. 討論59-61
• 總結(jié)與展望61-66
• 參考文獻(xiàn)66-73
• 附錄73-85
• 附錄 1：實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備73-74
• 附錄 2：實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑配方74-75
• 附錄 3：綜述75-85
• 參考文獻(xiàn)82-85
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷以及碩士期間發(fā)表論文、所獲獎(jiǎng)勵(lì)85-86
• 致謝86

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本文編號(hào)：269090