【摘要】：器官移植是中晚期器官衰竭患者重要的治療方法,為解決臨床供體短缺問題人們將目光投向了異種移植。豬在生理學特性、器官匹配度等方面與人類極為相似,且具有繁殖率高、遺傳性狀穩(wěn)定等特點,是最適合異種移植的供體。所有豬源細胞均存在豬內源性反轉錄病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV),完整的病毒粒子可釋放到胞外。它以前病毒、多拷貝方式整合在宿主基因組中,不能用常規(guī)的培育無特定病原體(Specefic pathogen free,SPF)豬、免疫抑制等方法去除。已證實PERV可在體外感染多種人源細胞,且與致瘤性的鼠白血病病毒(Murine leukemia virus,MLV)、貓白血病病毒(Feline leukemia virus,Fe LV)等C型反轉錄病毒有相似的整合方式,這些都引起人們對異種移植誘發(fā)人獸共患病的擔憂。歐洲藥品管理局(EMEA)和美國食品藥物管理局(FDA)相繼頒布的行業(yè)指南,對臨床異種移植的倫理問題與病原安全性做出了明確的規(guī)定;國際異種移植協(xié)會(IXA)發(fā)布了無指定病原體(Designated pathogen free,DPF)豬的病原體名錄,也詳細描述了Ⅰ型糖尿病豬胰島產品在進行臨床試驗時的條件~([1])。為了充分利用我國豐富的小型豬資源,實驗室在前期工作中已對我國多種小型豬種的PERV拷貝數(shù)進行檢測。結果表明,與貴州香豬、巴馬小型豬等相比五指山小型豬具有PERV-A型、PERV-B型拷貝數(shù)低且無PERV-C型等優(yōu)勢,同時該近交系是連續(xù)20代以上的近親交配,基因純合度達到60%以上,易于構建醫(yī)用模型。因此,我們有望通過在選育的低拷貝五指山小型豬近交系中篩選出PERV基因缺陷型小型豬,進而培養(yǎng)出為臨床提供異種移植器官供體的新品系。本研究主要進行的工作內容包括對五指山小型豬近交系進行初步篩選,并經過確證實驗得到無PERV傳染性豬,做反轉錄酶活性檢測,對其中1頭豬做全基因組重測序。1、無PERV傳染性五指山小型豬的初步篩選采集五指山小型豬的股動脈血,分離PBMC細胞與HEK293細胞共培養(yǎng)4天后去除PBMC,提取HEK293細胞的總RNA,運用RT-PCR方法,檢測PERV結構基因gag、pol、env的表達情況,初步篩選出不釋放嗜人性PERV的小型豬作為候選。結果顯示105份HEK293細胞中有17份不存在PERV的表達,其對應的小型豬為候選無PERV傳染性小型豬。2、無PERV傳染性五指山小型豬的確證將與候選豬PBMC共培養(yǎng)的HEK293細胞繼續(xù)培養(yǎng)30~60天,每周收集一次細胞基因組DNA及總RNA,PCR及RT-PCR檢測HEK293細胞中是否有新出現(xiàn)的PERV結構基因,篩選出結果始終為陰性的樣品。結果顯示17份樣品中12份始終無PERV存在與表達。在HEK293細胞培養(yǎng)過程中,每次傳代前收集細胞上清,經處理后做反轉錄酶活性檢測。測量的OD405值小于標準曲線縱軸截距的2倍即為無效值,說明無反轉錄酶活性。若始終檢測不到反轉錄酶活性,說明無PERV病毒粒子釋放到胞外,則驗證該頭豬確為無PERV傳染性五指山小型豬。結果顯示12份樣品中有8份始終檢測不到反轉錄酶活性,該8頭豬確為無PERV傳染性五指山小型豬。3、無PERV傳染性豬全基因組序列測定對其中1頭生長狀況良好的無PERV傳染性五指山小型豬(體號:452)進行全基因組重測序,提取其PBMC細胞的基因組DNA,利用IlluminaHiSeq 4000平臺完成,選定的參考基因組為F_(20)五指山近交系豬(Gen Bank:AJKK01000000.1)。對測序數(shù)據(jù)進行質量控制,結果表明測序質量好。對測序結果、與參考基因組比對結果、變異信息注釋結果進行統(tǒng)計。提取WZSP452中所有PERV-pol基因片段發(fā)現(xiàn)序列均不完整;分析WZSP452中唯一包含gag、pol、env結構基因的scaffold5028得出,三個基因均提前終止,未完全表達。4、帶有N堿基的pol序列基因克隆與序列分析為獲得scaffold640的pol中缺失N堿基的準確序列信息,設計并合成452號豬scaffold640 pol上下游引物,用PCR的方法擴增scaffold640 pol全長,與p MD-18T載體相連后在E.coli DH5α感受態(tài)細胞中轉化,對菌落PCR鑒定及雙酶切鑒定正確的陽性質粒測序。測序信息與全基因組序列結果進行比對從而獲得N堿基的完整信息。我們通過對篩選出的無PERV傳染性五指山小型豬中的一頭進行全基因組重測序,鑒定出是PERV-pol基因缺陷型豬。這是國內外首次通過近交培育結合自然篩選方法獲得,具有經濟、安全等優(yōu)點。本研究結果推動了五指山小型豬PERV缺陷型新品系的建立,有利于我國小型豬的開發(fā)和利用,為異種移植提供合適供體。
【圖文】：

ERV 是 C 型 RNA 病毒，屬哺乳動物反轉錄動物科（Retroviridae毒屬（Mammalian retroviridae），以前病毒的形式整合在宿主基隨染色體的復制而復制[38~40]。它最早是在 1971 年由 Armstrong內發(fā)現(xiàn)的一類內源性病毒粒子[41]。PERV 的基因結構是單股、正，單體長 7~9kb，兩端是 5'、3'非編碼區(qū)（noncoding region），、pol、env 三個編碼基因，，5'端有甲基化帽結構，3'端有多聚 A 尾（ 1）。兩端的長末端重復序列（Long terminal repeat, LTR）具有功能，可調控病毒轉錄、復制與整合[42]；gag 區(qū)可編碼核心蛋白，如衣殼蛋白、基質蛋白等；pol 區(qū)可編碼反轉錄酶（RT）、蛋和整合酶（IN），對于病毒反轉錄及整合入宿主基因組中尤為重可編碼病毒的囊膜蛋白[43]。

豬內源性反轉錄病毒 pol 基因篩選結果情況 細胞共培養(yǎng) 4 天后 3 遍以去除 PBMC基因的方法來檢測 為陽性對照，以無示：陽性對照在 50及陰性對照均未見預M a b c d e f
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R-332

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

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相關博士學位論文 前3條

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相關碩士學位論文 前1條

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本文編號：2684590