【摘要】：人類呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, HRSV)是世界范圍內(nèi)引起各年齡組下呼吸道感染的重要病毒病原體之一,尤見于嬰幼兒、老年人和免疫抑制個(gè)體,但臨床上至今尚無安全有效的疫苗。本課題的研究目的是篩選出一種或幾種HRSV的理想純化方法,并對(duì)不同純化產(chǎn)物進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià),為HRSV裂解純化疫苗的研制積累一定的基礎(chǔ)資料。研究?jī)?nèi)容主要包括：HRSV在人二倍體KMB17細(xì)胞上的大量繁殖、病毒收獲液的超濾濃縮、HRSV不同方法的純化和純化條件的探索,以及純化產(chǎn)物的免疫原性評(píng)價(jià),并對(duì)滅活劑、佐劑和免疫程序等免疫原性的影響因素進(jìn)行探索。 使用細(xì)胞工廠和羅氏瓶?jī)煞N容器培養(yǎng)HRSV,兩者均可獲得較高感染性滴度的病毒。細(xì)胞工廠培養(yǎng)HRSV的最佳條件還需進(jìn)一步探索。 將病毒收獲液以100kD濾膜包超濾濃縮30倍和103倍后,分別使用蔗糖密度梯度離心法和Sepharose 4FF凝膠過濾層析法進(jìn)行純化,并對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行感染性滴度檢測(cè)、SDS-PAGE還原電泳分析及Western blot鑒別。經(jīng)還原電泳,2種純化方法制備的純化產(chǎn)物都在60～70kD間呈現(xiàn)一主要條帶,Western blot證實(shí)為HRSV特異性F蛋白。結(jié)果表明Sepharose 4FF凝膠過濾層析法比蔗糖密度梯度離心法更適合于HRSV的純化,效果更好、效率更高。但柱體積、上樣量、洗脫流速等條件會(huì)對(duì)純化效果產(chǎn)生影響。 將蔗糖密度梯度離心和Sepharose 4FF凝膠過濾層析2種方法純化HRSV所得樣品免疫ICR小鼠,抗體陽轉(zhuǎn)率相同,中和抗體幾何平均效價(jià)(GMT)相近,雖然免疫劑量不同(前者的病毒蛋白含量是后者的2.5倍),但二者的免疫原性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明Sepharose 4FF凝膠過濾層析法純化產(chǎn)物的免疫原性較高。 在純化樣品的免疫原性影響因素的探索中,甲醛滅活組的抗體陽轉(zhuǎn)率和中和抗體GMT都比β-丙內(nèi)酯滅活組的高；鋁佐劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性疫苗的免疫原性影響不大；雖然Od、7d、14d和0d、28d兩個(gè)免疫程序均能誘導(dǎo)相對(duì)較高的中和抗體水平(1：9.51～1：11.31),但結(jié)果提示多針免疫有助于提高抗體陽轉(zhuǎn)率和中和抗體效價(jià)。
【圖文】：

圖2.蔗糖密度梯度離心純化組分的感染性滴度及蛋白含量Fig2.InfeetionstiterandProteineontentofPurifiedfraetionsofHRSVbysuerosdensitygradienteentrifugationSDS一PAGE還原電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，17個(gè)組分中，僅7一n號(hào)5個(gè)組分都在60一7okD間可見一主要的蛋白帶，，與HRSVF蛋白63kD分子量接近(見圖3)，推測(cè)目的病毒可能就集中在這5個(gè)樣品中。W亡Stemblot證實(shí)上述5個(gè)組分的60一7OkD間的條帶具有HRSV特異性(見圖4)。但病毒培養(yǎng)液中的牛皿清白蛋白66k分子量與F蛋白分子量相近，無法通過SDS一PAGE將二者分開。牛血清白蛋白殘留量檢測(cè)結(jié)果顯示7號(hào)樣的牛血清白蛋白含量為15.5林g/ml、約占總蛋白含量的0.05%)，所以60一70kD間的條帶是HRSVF蛋白和少量牛血清白蛋白的混合物上述5個(gè)組分中，以7號(hào)和8號(hào)組分的目的病毒含量較高，這與圖2所顯示的病毒滴度有一個(gè)小峰相吻合。從蛋白含量曲線上可以看出，這5個(gè)組分的蛋白含量遠(yuǎn)低于2一6號(hào)組分，后者主要是一些雜蛋白。因?yàn)?號(hào)組分與8~11號(hào)組分的蛋白條有差異，在50一70kD間有3個(gè)條帶故我們將7號(hào)組分作為一個(gè)單獨(dú)樣品，將電泳條帶相似的8、9、10、11號(hào)組分合

分;3:9號(hào)組分;4:10號(hào)組分;5:11號(hào)組分;6:30倍濃縮HRSV(30倍稀釋還原)。圖3.蔗糖密度梯度離心純化組分的電泳圖Fig3.EleetroPhoretieProfileofPurifiedfraetionofHRSVbysuerosedensitygradienteentrifugation8號(hào)組分;3:分;9號(hào)組分;4:10號(hào)組5:11號(hào)組分;圖4.蔗糖密度梯度離心純化組分的Westernb一ot分析Fig4.WesternblottingofPurinedfraetionsofHRSVbysuerosedensitygradienteentrifugation
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2684447