發(fā)布時(shí)間：2020-05-22 23:25

【摘要】：目的:鼠傷寒沙門(mén)菌spv基因是沙門(mén)菌感染中重要的致病因子。spv含有三個(gè)必需基因:正性轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因spvR和兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因spvB和spvC。本研究通過(guò)建立鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染人腸黏膜上皮細(xì)胞的模型,觀察下調(diào)spvB基因表達(dá)后,對(duì)于細(xì)胞自噬、自噬相關(guān)蛋白的影響,并探討p38MAPK信號(hào)通路在鼠傷寒沙門(mén)菌spvB基因影響腸上皮細(xì)胞自噬中的作用,為沙門(mén)菌感染的臨床治療提供新的研究思路和靶點(diǎn),為進(jìn)一步研究耐藥及非耐藥沙門(mén)菌株中spvB對(duì)自噬影響的差異及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:一、鼠傷寒沙門(mén)菌spvB基因?qū)τ谀c黏膜上皮細(xì)胞自噬的影響。分別使用攜帶spvB基因的鼠傷寒沙門(mén)氏菌野生株STM-211、敲除spvB基因的鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變株STM-ΔspvB和回補(bǔ)株STM-c-spvB與處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的腸黏膜上皮細(xì)胞Henle-407細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),再使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu);單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)染色后鏡下觀察;稀釋涂板作胞內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù);免疫印跡法(Western Blot,WB)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá),并比較各感染組和對(duì)照組之間的自噬強(qiáng)度是否相同。二、鼠傷寒沙門(mén)菌spvB基因在影響Henle-407細(xì)胞自噬中p38MAPK信號(hào)通路的作用。在原有的感染模型基礎(chǔ)上增加p38MAPK通路抑制劑SB203580進(jìn)行干預(yù)對(duì)照。于共培養(yǎng)后的1h和3h收集細(xì)胞,通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)p38的磷酸化水平和自噬標(biāo)志蛋白LC3、p62的表達(dá)水平;免疫熒光染色觀察自噬蛋白LC3的表達(dá)及分布。結(jié)果:一、鼠傷寒沙門(mén)菌spvB基因?qū)τ谀c黏膜上皮細(xì)胞自噬的影響。1.使用透射電鏡觀察鼠傷寒沙門(mén)菌感染后Henle-407細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),在感染后的1h,正常對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)到明顯的自噬發(fā)生,而野生株感染組STM-211和STM-ΔspvB感染組鏡下可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體和自噬溶酶體結(jié)構(gòu),以及大量的沙門(mén)菌囊泡(Salmonella-containing vacuoles,SCV)。2.MDC染色后熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示在感染后的1h,各組細(xì)胞內(nèi)的綠色點(diǎn)狀熒光均有不同程度地增多。在空白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)僅有少許的熒光分布,熒光細(xì)胞的數(shù)量也明顯少于受試菌感染組。STM-ΔspvB感染組的胞內(nèi)熒光分布強(qiáng)度及熒光細(xì)胞數(shù)明顯高于STM-211感染組。3.細(xì)胞內(nèi)活菌稀釋涂板計(jì)數(shù)在細(xì)菌干預(yù)后的1h,各感染組培養(yǎng)基中的細(xì)菌總量未明顯差別,從2h開(kāi)始,STM-ΔspvB感染組的細(xì)菌存活量明顯低于STM-211和STM-c-spvB感染組,4h時(shí),細(xì)菌數(shù)目雖有增長(zhǎng)而STM-ΔspvB組較STM-211和STM-c-spvB組的數(shù)量差距依然很明顯。4.WB檢測(cè)野生株、突變株和回補(bǔ)株感染的細(xì)胞自噬水平與空白對(duì)照組相比,在感染后的1h,STM-ΔspvB組LC3Ⅱ的表達(dá)水平顯著高于STM-211組和STM-c-spvB組,底物p62蛋白水平則較STM-211和STM-c-spvB感染組下降;感染后3h,LC3Ⅱ和p62蛋白水平表達(dá)保持感染1h時(shí)的趨勢(shì)且程度更大。二、鼠傷寒沙門(mén)菌spvB基因在影響Henle-407細(xì)胞自噬中p38MAPK信號(hào)通路的作用。1.不同感染組p38MAPK通路的表達(dá)水平在不同組的沙門(mén)菌作用不同時(shí)間后,各個(gè)感染組的p38磷酸化水平均較對(duì)照組增高;感染后的1h,STM-ΔspvB組p38的磷酸化水平顯著高于STM-211和STM-c-spvB感染組,這種趨勢(shì)一直持續(xù)到2h和4h;并且STM-211、STM-ΔspvB或STM-c-spvB感染組隨著時(shí)間增加,p38的磷酸化水平也呈升高趨勢(shì)。2.WB檢測(cè)抑制P38通路后各組細(xì)胞的自噬水平經(jīng)SB203580處理后,對(duì)照組、STM-211和STM-c-spvB感染組的LC3Ⅱ水平較前無(wú)明顯差異,而STM-ΔspvB感染組則顯著降低;p62蛋白水平STM-ΔspvB感染組較SB203580處理前顯著升高,其它組較處理前無(wú)明顯差異。感染后3h,LC3Ⅱ和p62蛋白水平表達(dá)保持感染1h時(shí)的趨勢(shì),經(jīng)SB203580干預(yù)后,STM-ΔspvB組LC3Ⅱ表達(dá)量顯著升高,p62表達(dá)量顯著降低,而STM-211和STM-c-spvB組LC3Ⅱ和p62蛋白水平較未經(jīng)SB203580干預(yù)組無(wú)明顯改變。3.免疫熒光檢測(cè)在抑制P38通路后各組細(xì)胞的自噬水平共培養(yǎng)結(jié)束后2h,與對(duì)照組相比,各感染組細(xì)胞核周的LC3點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)顯著增加;STM-ΔspvB組顯著多于STM-211組。經(jīng)SB203580處理后,STM-ΔspvB組LC3顆粒熒光小點(diǎn)數(shù)量明顯減少,STM-211組較處理前無(wú)明顯改變。結(jié)論:1.spvB基因在沙門(mén)菌感染腸黏膜上皮細(xì)胞Henle-407抑制自噬的活性,以利于細(xì)菌自身的存活。2.p38通路在沙門(mén)菌感染時(shí)被活化,而spv B對(duì)p38通路的抑制作用是其抑制細(xì)胞自噬的關(guān)鍵機(jī)制之一。
【圖文】：

圖 1 電鏡觀察不同組的自噬結(jié)構(gòu)ig.1 autophagosomes and autolysosomes in Henle-407 cell after infected with S.typhimurby TEM.注：黑色箭頭所指為沙門(mén)菌囊泡，白色箭頭所指為自噬體。 MDC 染色后觀察不同組的自噬強(qiáng)度MDC 是一種細(xì)胞自噬活性檢驗(yàn)的示蹤劑，主要能夠?qū)?xì)胞的自噬溶酶溶酶體進(jìn)行選擇性地?zé)晒馊旧�。在�?jīng)過(guò)共培養(yǎng)后的 1h，各感染組的 Henle胞內(nèi)的綠色點(diǎn)狀熒光均有不同程度地增多。在空白對(duì)照組，細(xì)胞內(nèi)僅有熒光分布，而其熒光強(qiáng)度明顯弱于受試菌感染組，，提示為被熒光標(biāo)記的或者基礎(chǔ)水平的自噬，同時(shí)證明了沙門(mén)菌感染誘導(dǎo)了 Henle-407 細(xì)胞發(fā)生。STM-ΔspvB 感染組的胞內(nèi)熒光分布強(qiáng)度明顯高于 STM-211 感染組，胞的數(shù)量也多于 STM-211 感染組(P<0.05)。見(jiàn)圖 2B&C。

圖 2 各組細(xì)胞 MDC 染色（×40）.空白對(duì)照組；B.STM-211 感染組；C.STM-ΔspvB 感染組；D.各組熒光細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)情況 *P<0.05，**P<0.01g.2 MDC staining of each group of cells（×40）A. Control group; B.STM-211 infection grouC.STM-ΔspvB infection group; D.statistics of fluorescent cells in each group .*P<0.05,**P<0.01.3 細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量的檢測(cè)經(jīng)過(guò)共培養(yǎng) 1h、2h 和 4h 后，收集不同組細(xì)胞并進(jìn)行胞內(nèi)活菌數(shù)的測(cè)定。檢測(cè)，在細(xì)菌干預(yù)后的 1h，各感染組培養(yǎng)基中的細(xì)菌總量未明顯差別，從 2始，STM-ΔspvB 感染組的細(xì)菌存活量明顯低于 STM-211 和 STM-c-spvB 感染（P<0.05），4h 時(shí)，細(xì)菌數(shù)目雖有增長(zhǎng)但是 STM-ΔspvB 組較 STM-211 和TM-c-spvB 組的數(shù)量差距依然很明顯（P<0.05）。見(jiàn)圖 3。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R378

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