【摘要】：目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種成體多能干細(xì)胞,體外易獲得,分裂增殖快,可以向多個(gè)方向分化,是目前干細(xì)胞治療領(lǐng)域研究和使用較多的一類(lèi)干細(xì)胞。在干細(xì)胞治療研究中,BMSCs通過(guò)血液循環(huán)遷移聚集到受損組織的過(guò)程稱(chēng)為歸巢,這個(gè)過(guò)程是干細(xì)胞治療的關(guān)鍵部分,直接關(guān)系到干細(xì)胞在損傷組織處聚集的數(shù)量和修復(fù)的效果。目前歸巢的BMSCs來(lái)源可分為體內(nèi)自有和體外給予。內(nèi)源性的BMSCs數(shù)量極少,歸巢率較低;外源性注射的BMSCs在損傷組織處歸巢率也低,因此如何提高BMSCs的歸巢能力是干細(xì)胞治療領(lǐng)域亟待解決的難點(diǎn)。低強(qiáng)度脈沖超聲(Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)可以增強(qiáng)體外培養(yǎng)的BMSCs的增殖能力和多向分化能力,并且在促進(jìn)骨折愈合的研究過(guò)程發(fā)現(xiàn)其也可以增強(qiáng)體內(nèi)BMSCs的動(dòng)員和補(bǔ)充,從而加速骨折愈合,但迄今為止未見(jiàn)更深入的研究報(bào)導(dǎo)。本課題旨在通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)研究LIPUS對(duì)BMSCs的遷移及歸巢能力的影響,并且通過(guò)基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)LIPUS對(duì)BMSCs歸巢相關(guān)基因的調(diào)節(jié),深入探討其機(jī)制,以期為L(zhǎng)IPUS應(yīng)用于干細(xì)胞治療提供更為堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù),促進(jìn)LIPUS在干細(xì)胞治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。方法1.篩選能促進(jìn)BMSCs遷移的適宜超聲強(qiáng)度。根據(jù)LIPUS輻照聲強(qiáng)不同將BMSCs分為四組:對(duì)照組、30mW/cm~2組、60mW/cm~2組和90mW/cm~2組。超聲組細(xì)胞按照各組聲強(qiáng)輻照20min,對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行假輻照。通過(guò)細(xì)胞劃痕、transwell小室模型檢測(cè)各組細(xì)胞的體外遷移能力,FITC-鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)的變化。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LIPUS促進(jìn)BMSCs遷移歸巢。隨機(jī)選擇30只雌性SD大鼠(對(duì)照組和LIPUS組各15只),進(jìn)行單側(cè)后肢股骨骨缺損造模。對(duì)BMSCs采用綠色熒光標(biāo)記并經(jīng)LIPUS預(yù)處理(30mW/cm~2,20min/d,2d)后于大鼠尾靜脈注射。X片觀察缺損位點(diǎn)的愈合過(guò)程(2周)。兩周后處死大鼠,HE染色觀察新生骨區(qū),熒光顯微鏡觀察靶區(qū)BMSCs的綠色熒光表達(dá)。3.深入探討機(jī)制。對(duì)LIPUS預(yù)處理(30mW/cm~2,20min/d,2d)的BMSCs進(jìn)行基因表達(dá)譜測(cè)序,統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和超聲組差異表達(dá)的基因,并且對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO富集,選取表達(dá)量上調(diào)的4個(gè)與細(xì)胞遷移相關(guān)的基因(Itga8,Ccl5,Tm7sf2,Tuba3b)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。采用測(cè)溫裝置對(duì)LIPUS輻照過(guò)程中溫度的變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果1.劃痕后0h、24h及48h對(duì)各組細(xì)胞的劃痕面積進(jìn)行測(cè)量,超聲組的面積小于對(duì)照組(P0.05),30mW/cm~2組的24h劃痕面積(0.47±0.21mm~2)和48h的劃痕面積(0.19±0.10mm~2)與其他組比均為最小(P0.05)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中,較之于對(duì)照組,超聲組穿過(guò)transwell上室的BMSCs數(shù)量更多,30mW/cm~2組最多(213.0±34.76個(gè)),是對(duì)照組的2.39倍(P0.05)。F-actin染色實(shí)驗(yàn)中,超聲組的細(xì)胞骨架變狹長(zhǎng),縱軸方向可見(jiàn)更多的應(yīng)力絲,數(shù)量及熒光強(qiáng)度也明顯增加,超聲組中30mW/cm~2組的熒光強(qiáng)度最高(125.43±17.43,P0.05)。2.造模后即刻X片檢測(cè)可見(jiàn)對(duì)照組及LIPUS組大鼠的右側(cè)后肢股骨,均存在大小一致的圓形缺損,提示骨缺損造模成功。造模2周后,X片觀察到LIPUS組股骨的缺損已經(jīng)愈合,對(duì)照組缺損未完全閉合。HE染色可見(jiàn)LIPUS組骨髓區(qū)成骨細(xì)胞較多。熒光顯微鏡下LIPUS組骨缺損部位綠色熒光強(qiáng)度更高(12.06±0.23),而對(duì)照組熒光強(qiáng)度較低(38.2±0.29),二者比較有顯著性差異(P0.05)。3.基因表達(dá)譜測(cè)序共篩選出差異基因237條,LIPUS組上調(diào)表達(dá)39條,下調(diào)表達(dá)198條。分子功能富集顯示33個(gè)基因和G-蛋白偶聯(lián)受體(P0.001)活性相關(guān),生物過(guò)程富集顯示42個(gè)基因與G-蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)相關(guān)(P0.001);分子組成富集顯示LIPUS組BMSCs有71個(gè)基因與細(xì)胞膜的整體組成相關(guān)。對(duì)與細(xì)胞遷移相關(guān)的上調(diào)基因Itga8,Ccl5,Tm7sf2,Tuba3b進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果與基因表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果一致,提示本研究中基因表達(dá)譜測(cè)序所得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)是有效可靠的。LIPUS輻照過(guò)程中對(duì)照組和LIPUS組的測(cè)溫結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論LIPUS可以促進(jìn)BMSCs體外遷移能力,聲強(qiáng)為30mW/cm~2時(shí)促進(jìn)效應(yīng)最為明顯。LIPUS預(yù)處理可以作為一種提高外源性BMSCs體內(nèi)歸巢率的手段,其機(jī)制可能是LIPUS的機(jī)械效應(yīng)對(duì)BMSCs細(xì)胞膜表面的的G-蛋白偶聯(lián)受體產(chǎn)生了作用,從而使得BMSCs在體內(nèi)外的遷移和歸巢能力提高。
【圖文】：

將超聲組和對(duì)照組的細(xì)胞加入24孔8μm的transwell小室上室中，24h后對(duì)遷移過(guò)小室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，，倒置相差顯微鏡下拍照（圖1-3），對(duì)各組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行對(duì)比（圖1-4），各超聲組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量均多于對(duì)照組（89.53±19.27個(gè)），且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。超聲組中，LIPUS強(qiáng)度為30mW/cm2時(shí)穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量最多（213.0±34.76個(gè)，P<0.05），說(shuō)明LIPUS具有刺激BMSCs遷移穿過(guò)transwell小室的能力，30mW/cm2的LIPUS促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力最強(qiáng)。

出LIPUS輻照后，BMSCs的微絲變的粗長(zhǎng)，數(shù)量增多，細(xì)胞骨架感受了來(lái)自L(fǎng)IPUS的聲學(xué)信號(hào)，使得F-actin的表達(dá)發(fā)生了改變。用Image J軟件進(jìn)一步測(cè)量各組熒光值（圖1-6），結(jié)果顯示超聲組的相對(duì)熒光強(qiáng)度均高于對(duì)照組（51.94±12.76，P<0.05），各超聲組之間，30mW/cm2組的相對(duì)熒光強(qiáng)度（125.43±17.43）高于其他兩組（P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2673795