【摘要】：自身免疫性疾病是由機(jī)體免疫功能紊亂而引起自身免疫反應(yīng)的慢性疾病,目前全球有數(shù)以千萬的人正遭受此類疾病的困擾,但病因仍然不明。核酸酶在DNA復(fù)制、損傷、錯(cuò)配修復(fù)和維護(hù)基因組DNA穩(wěn)定性中扮演著重要作用,Trex1是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最豐富的核酸外切酶,可降解胞內(nèi)中異�；蝈e(cuò)配的DNA。近年來發(fā)現(xiàn)Trex1的位點(diǎn)突變與多種自身免疫性疾病有關(guān),探討二者間的關(guān)系對闡明自身免疫反應(yīng)病理機(jī)制有著重要意義。本研究通過運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)與重組蛋白的表達(dá)、Western Blot、qRT-PCR流式細(xì)胞術(shù)等方法,對Trex1及其突變對自身免疫性疾病的關(guān)系進(jìn)行了探討。我們首先通過CRISPR/Cas9技術(shù)建立了 Trex1基因敲除的細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)Trex1基因缺失可以引起了 DNA免疫通路的應(yīng)答。Trex1多種位點(diǎn)突變中,D18N突變發(fā)生于DNA催化酶活性的結(jié)構(gòu)域,與自身免疫性疾病家族性凍瘡樣狼瘡(FCL)有關(guān),但未見較深入研究報(bào)告。因此,我們研究了 Trex1 D18N突變對自身免疫反應(yīng)的影響。我們首先在E.coli構(gòu)建并表達(dá)了 Trex1 D18N重組蛋白。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Trex1 D18N突變造成DNA酶活性的喪失。接著,通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Trex1 D18N小鼠模型,與野生型相比,該模型在無刺激的情形下,胚胎成纖維細(xì)胞有較高水平的I型干擾素的表達(dá),血漿中炎癥因子表達(dá)明顯升高,體內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)增高。這些結(jié)果表明Trex1 D18N突變可以造成自身免疫反應(yīng),其所構(gòu)建的Trex1 D18N可做為自身免疫性疾病研究的模型,為Trex1在自身免疫性疾病中的作用機(jī)制及靶點(diǎn)研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

首先我們選定了在Ｔｒｅｘｌ的第十八位氨基酸堿基序列位置前后設(shè)計(jì)了三個(gè)逡逑ｓｇＲＮＡ，將目的基因Ｔｒｅｘｌ的三個(gè)不同ｓｇＲＮＡ經(jīng)過退火后與酶切后的ＰＸ４５８連接，逡逑經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的菌液進(jìn)行測序并比對（圖１－１），結(jié)果顯示三個(gè)ｓｇＲＮＡ都有連接上ｐＸ４５８逡逑載體，說明載體構(gòu)建成功。逡逑．Ｉ邋＇邋＇邋Ｉ邋１邋？邋｜邐｜邋１邋？邋？邋？邋｜邐｜邐＇邋Ｉ邋＇邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋＊邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋＊邋｜邋？邋｜邋Ｉ邋＊邋？邋？邋？邋Ｉ邋Ｉ邋？邋Ｉ邋？邋Ｉ邋Ｉ邋？邋Ｉ邋？邋Ｉ邋Ｉ邋？邋？邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋？邋？邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｔ邋｜邋Ｉ邋Ｉ逡逑邐＾邐３０邐４０邐５０邐６０邐７０邐８０邐Ｓ０邐１００邐１１０邋＾逡逑ｒｉｇｌ－ＤｌＳＮ１？邐ＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣ：ＣＡＴＣｒｒＣ￣－ＡＧＡＣＣ逡逑ｐＸ４５８－ｓｇｌ－Ｔｒｅｘｌ－Ｄ１８Ｎ邋ＢＩＦ邐ｉ邋：邋Ｃ：邋：３：ＧＧ．；．；３＾．ＣＧ．；＾ＣＡＣＣ－３Ｇ．；ＣＣＣ：ＣＡ：邋？：．邋：邋Ｃ邋：邋．．；３．；ＣＣＧ：邋；邋：邋：ＡＧ？３Ｃ：ＡＧＡ．；．；：Ａ３：Ａｉ．＜３：邐：－邋：邋．邋．邋：？逡逑ｙ邋，邋》Ｉ１１？？Ｉ｜｜｜雷邋ｌ？｜V尊邋Ｉ邋ｉ邋警邋？ｉ邋Ｉ邋ｉ邋g？邋？邋Ｉ邋春邋ｉ邋？尊邋Ｉ邋？言邋《邋ｉ邋Ｉ邋ｉ邋？邋？邋？邋１１邐？邋Ｉ邋ｉ？？ｉ邋Ｉ邋ｉ邋ｉ邋？

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【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R593.2;R-332

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本文編號：2660208