【摘要】：毛發(fā)是皮膚重要的附屬結(jié)構(gòu),在個(gè)體中分布很廣,幾乎遍布全身。它除增加信息交流和美觀功能外,還具有具有防御、保護(hù)的作用。毛發(fā)位于皮下的部分被稱為毛囊,毛囊的組成和功能較為復(fù)雜,目前有研究認(rèn)為:毛囊不僅能調(diào)控毛發(fā)的生長(zhǎng),其內(nèi)的干細(xì)胞還參與皮膚表皮細(xì)胞的更新和修復(fù)。毛囊是具有周期性生長(zhǎng)特性的一種特殊器官,其周期分為生長(zhǎng)期、退化期和靜止期。在靜止期,毛囊細(xì)胞受到某些因素的刺激,會(huì)再次進(jìn)入生長(zhǎng)期。通常毛發(fā)的生長(zhǎng)和其周期變化涉及一系列多能上皮干細(xì)胞與其鄰近的間充質(zhì)細(xì)胞的相互作用,從間充質(zhì)細(xì)胞中發(fā)出的活化信號(hào)指導(dǎo)多能干細(xì)胞的遷移和分化,從而維持毛囊生長(zhǎng)及其周期推進(jìn),如此周而復(fù)始在哺乳動(dòng)物的整個(gè)生命期間循環(huán)往復(fù)。毛發(fā)的維持是毛囊以一種干細(xì)胞依賴的方式而進(jìn)行的周期性再生。其周期性自我更新以及生長(zhǎng)依賴于毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells,HFSCs)周期性增殖和分化。如果毛囊各周期轉(zhuǎn)換中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題,就可能會(huì)影響毛囊的生長(zhǎng),進(jìn)而出現(xiàn)毛囊相關(guān)疾病,例如脫發(fā)、斑禿等。毛囊干細(xì)胞是毛囊中的原始細(xì)胞,主要存在于毛囊外根鞘隆突部中bulge區(qū),也是皮膚干細(xì)胞的所在地之一。其通過(guò)自我更新維持毛囊周期循環(huán)、表皮新陳代謝,有文獻(xiàn)認(rèn)為它還參與了皮膚創(chuàng)傷愈合,能源源不斷地為表皮基底層提供干細(xì)胞。目前,bulge區(qū)是毛囊干細(xì)胞主要棲息地的學(xué)說(shuō)已經(jīng)得到普遍認(rèn)同。Cdc42是小G蛋白R(shí)ho家族蛋白中的重要成員,體內(nèi)的Cdc42有兩種形式,即GDP結(jié)合的無(wú)活性狀態(tài)與GTP結(jié)合的活性狀態(tài)。Cdc42在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有分子開關(guān)作用。活化的Cdc42通過(guò)作用于細(xì)胞內(nèi)一系列下游效應(yīng)底物來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和細(xì)胞周期等一系列重要生命現(xiàn)象,其最重要的功能是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組。近期研究發(fā)現(xiàn),小G蛋白R(shí)ho家族成員對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有重要調(diào)控作用。本課題組前期研究揭示RhoA可以通過(guò)MEKK1/JNK信號(hào)通路調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與分化,促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合。我們利用引進(jìn)的Cdc42Loxp/Loxp小鼠和K5/Cre~+小鼠,依據(jù)Cre/loxp重組酶系統(tǒng)原理(1)建立皮膚角質(zhì)細(xì)胞特異性Cdc42基因敲除小鼠。(2)探討Cdc42對(duì)皮膚及毛囊發(fā)育的影響。(3)進(jìn)一步探討Cdc42對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合的影響及可能參與的相關(guān)信號(hào)機(jī)制,從而為研究和治療脫發(fā)相關(guān)疾病及皮膚的創(chuàng)傷修復(fù)作用及機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。第一章皮膚角質(zhì)細(xì)胞特異性Cdc42基因敲除小鼠模型的建立及對(duì)小鼠毛囊干細(xì)胞的影響研究背景和目的由于以往對(duì)Cdc42的研究大多局限于細(xì)胞水平,后發(fā)現(xiàn)Cre/loxp重組酶系統(tǒng)后,實(shí)現(xiàn)了在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行條件性基因敲除,即實(shí)現(xiàn)目的基因在動(dòng)物體內(nèi)特定組織及特定時(shí)間內(nèi)的敲除。目前,條件基因敲除動(dòng)物已經(jīng)成為用于研究某個(gè)特定基因在動(dòng)物體內(nèi)特定部位功能的較好的動(dòng)物模型。Cre/loxp條件性基因敲除技術(shù)是目前國(guó)際上最先進(jìn)的基因敲除技術(shù),廣泛用于動(dòng)物體內(nèi)目的基因作用的研究。角蛋白5 (keratin5,K5)是皮膚表皮層的角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的一種角蛋白。正常情況下,K5和K14二者成對(duì)表達(dá),是角質(zhì)形成細(xì)胞分化的標(biāo)志物之一。本研究選用角蛋白5(K5)基因?yàn)閱?dòng)子,用它引導(dǎo)和限定Cre重組酶基因在角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),以獲得皮膚角質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠,為應(yīng)用Cre/loxp系統(tǒng)研究目的基因在皮膚的發(fā)生、發(fā)育等及皮膚附屬器的形成和功能中的作用創(chuàng)造條件。毛發(fā)由毛囊生成,毛囊細(xì)胞呈周期性生長(zhǎng),如果毛囊各周期轉(zhuǎn)換中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題,就可能會(huì)影響毛發(fā)的生長(zhǎng),進(jìn)而出現(xiàn)毛發(fā)相關(guān)疾病。毛發(fā)的維持是毛囊以一種干細(xì)胞依賴的方式而進(jìn)行的周期性再生。其周期性自我更新以及生長(zhǎng)依賴于毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells, HFSCs)周期性增殖和分化。毛囊干細(xì)胞是毛囊中的原始細(xì)胞,主要存在于毛囊外根鞘隆突部中bulge區(qū),有文獻(xiàn)認(rèn)為bulge區(qū)也是皮膚干細(xì)胞的所在地之一。本研究利用Cre/loxp系統(tǒng)的條件性基因敲除原理為理論基礎(chǔ),利用Cdc42Loxp/Loxp轉(zhuǎn)基因小鼠和K5-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠,構(gòu)建皮膚角質(zhì)細(xì)胞特異性Cdc42基因敲除小鼠,探討Cdc42在毛發(fā)周期循環(huán)以及對(duì)毛囊干細(xì)胞的生物學(xué)功能影響的作用。研究方法1.利用Cre/loxp重組酶系統(tǒng),將Cdc42loxp/loxp小鼠和K5-Cre~+/-轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交,其F1代小鼠中基因型分別為Cdc42loxp/+/-K5-Cre~+和Cdc42loxp/+/-K5-Cre-。而后利用 Cdc42lopx+/-K5-Cre~+/-小鼠與 Cdc42loxp/loxp 小鼠雜交,其后代獲取1/4比例在角質(zhì)細(xì)胞上敲除Cdc42的小鼠,簡(jiǎn)稱KO小鼠,基因型為Cdc42loxp/loxp/-K5-Cre~+;獲取1/2比例Cdc42未敲除(野生型)小鼠,簡(jiǎn)稱 WT 小鼠,基因型為 Cdc42loxp/+/K5-Cre-或 Cc42loxp/loxp/-K5-Cre-。通過(guò)PCR方法和Cdc42免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行基因水平和蛋白水平鑒定。按照準(zhǔn)確的日齡觀察出生后的KO小鼠和WT小鼠發(fā)育及皮膚和毛囊的大體發(fā)育;取出生后24天(P24天)～出生后70天(P70天)的KO小鼠和WT小鼠皮膚,將取材的皮膚放入4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片和染色。2.檢測(cè)指標(biāo):(1)大體觀察:大體觀察KO小鼠和WT小鼠皮膚和毛發(fā)的外觀和完整性,重點(diǎn)觀察毛發(fā)的周期性變化差異;(2)組織形態(tài):利用HE染色觀察處于毛發(fā)生長(zhǎng)周期不同階段KO小鼠和WT小鼠毛囊組織的變化及差異;(3) KO小鼠和WT小鼠在毛發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育有差異的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)記物K15的檢測(cè)和比較,以明確皮膚角質(zhì)細(xì)胞Cdc42基因敲除對(duì)毛囊干細(xì)胞維持和穩(wěn)定的影響;(4)利用脫毛誘導(dǎo)刺激毛囊干細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Cdc42基因敲除對(duì)毛囊干細(xì)胞動(dòng)員和增殖的影響。研究結(jié)果:1. PCR基因鑒定,K5-Cre~+為667bp特異條帶,Cdc42loxp/loxp為700bp特異性條帶,WT為600bp特異性條帶。K5-Cre~+且Cdc42loxp/loxp的小鼠為KO小鼠,基因型為Cdc42loxp/loxp-K5-Cre~+。皮膚表皮細(xì)胞的Cdc42免疫組化染色,未見KO小鼠皮膚角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Cdc42蛋白的表達(dá),說(shuō)明成功構(gòu)成皮膚角質(zhì)細(xì)胞Cdc42基因敲除小鼠。2.大體觀察結(jié)果:KO小鼠體型、大小及皮膚完整性等與WT小鼠比較無(wú)差別。P49天以前KO小鼠與WT小鼠相比毛發(fā)在萌出、萌出后的外觀、密度、長(zhǎng)度方面無(wú)差異。但P49天后KO小鼠出現(xiàn)進(jìn)行性由頭端向尾端的脫毛,至P64天左右,與對(duì)照WT小鼠相比,全身毛發(fā)明顯稀疏,之后無(wú)再生跡象,毛發(fā)周期性循環(huán)消失。3.組織形態(tài)觀察:KO小鼠出現(xiàn)脫毛表型后,其毛發(fā)的周期性循環(huán)消失,永久停留在靜止期。4.指標(biāo)檢測(cè):免疫組化K15檢測(cè)發(fā)現(xiàn):在P49天后,KO小鼠皮膚毛囊干細(xì)胞(bulge區(qū))明顯減少甚至耗竭消失。KO小鼠毛囊從第二個(gè)靜止期無(wú)法正常進(jìn)入第三個(gè)生長(zhǎng)期,KO小鼠毛囊干細(xì)胞的自然增殖能力減弱甚至消失。脫毛刺激后,KO小鼠毛囊干細(xì)胞動(dòng)員能力明顯減弱甚至消失;脫毛后10天,KO小鼠毛干萌出障礙。研究結(jié)論1、成功構(gòu)建皮膚角質(zhì)細(xì)胞特異性Cdc42基因敲除小鼠,并發(fā)現(xiàn):Cdc42基因敲除小鼠毛發(fā)在出生后49天逐漸出現(xiàn)進(jìn)行性脫落,毛發(fā)周期性循環(huán)消失。2、角質(zhì)細(xì)胞特異性Cdc42基因敲除小鼠在出生后49天,K15標(biāo)記的毛囊bulge區(qū)干細(xì)胞逐漸缺失,證明:Cdc42對(duì)毛囊干細(xì)胞的維持有促進(jìn)作用。3、伴隨著K15標(biāo)記的毛囊bulge區(qū)干細(xì)胞的缺失,Cdc42基因敲除小鼠毛囊干細(xì)胞的自然增殖和刺激后增殖能力減弱,毛發(fā)無(wú)法再生。說(shuō)明:Cdc42對(duì)毛囊干細(xì)胞的動(dòng)員和增殖能力有促進(jìn)作用。第二章角質(zhì)細(xì)胞Cdc42基因敲除對(duì)小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響研究背景和目的皮膚是機(jī)體最大的器官,其首要功能是將機(jī)體組織隔絕外界環(huán)境起到保護(hù)屏障的作用。由于創(chuàng)傷、燒傷、感染、腫瘤和代謝疾病等造成的皮膚損傷在臨床上十分常見。皮膚的創(chuàng)傷修復(fù)也是目前研究的熱點(diǎn)。皮膚創(chuàng)傷愈合是個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,涉及多種細(xì)胞、多個(gè)信號(hào)機(jī)制參與。愈合包括表皮和真皮的再生,表皮再生即是皮膚再上皮化(re-epithelialization)。創(chuàng)傷愈合過(guò)程中創(chuàng)口的再上皮化過(guò)程非常重要,上皮化延遲會(huì)導(dǎo)致傷口纖維化加重,產(chǎn)生明顯瘢痕組織。再上皮化過(guò)程中,主要由創(chuàng)口周圍表皮基底層表皮干細(xì)胞及創(chuàng)口附近表皮的附屬器中的表皮干細(xì)胞向傷口分化、增殖進(jìn)行修復(fù)。近年來(lái),越來(lái)越多的研究?jī)A向于研究再上皮化過(guò)程中毛囊干細(xì)胞發(fā)揮的作用,甚至有研究認(rèn)為,毛囊干細(xì)胞強(qiáng)大的分裂增殖潛能為干細(xì)胞移植帶來(lái)了希望。創(chuàng)傷的愈合過(guò)程是人體最復(fù)雜的生物過(guò)程之一,在人體受到各種傷害之后,各種各樣的生物信號(hào)途徑迅速激活并在此修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。如:絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)是介導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)答的重要信號(hào)系統(tǒng)。JNK, ERK, p38是MAPK家族主要成員,調(diào)節(jié)一系列生理病理生物學(xué)活動(dòng)。Wnt信號(hào)通路與皮膚的生長(zhǎng)發(fā)育、毛囊的周期再生以及創(chuàng)面的功能修復(fù)等生物學(xué)過(guò)程均有密切關(guān)系。研究證明Wnt信號(hào)途徑的激活是對(duì)創(chuàng)傷刺激的一種特殊反應(yīng)。而β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵作用因子。角質(zhì)細(xì)胞Cdc42基因敲除后導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)一系列毛囊發(fā)育障礙,包括進(jìn)行性脫毛,毛囊周期性循環(huán)消失,毛囊干細(xì)胞缺失。為進(jìn)一步探討皮膚角質(zhì)細(xì)胞Cdc42基因敲除對(duì)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的影響以及由于Cdc42基因敲除造成的毛囊發(fā)育異常尤其是毛囊干細(xì)胞的異常對(duì)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的影響及其作用機(jī)制,我們進(jìn)行了皮膚創(chuàng)傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)。研究方法1.分組:Control組(野生型小鼠,WT小鼠)2. 實(shí)驗(yàn)組(角質(zhì)細(xì)胞Cdc42基因敲除小鼠,KO小鼠)創(chuàng)傷模型:7-8周齡Cdc42基因敲除小鼠和同窩出生的野生型小鼠,背部右側(cè)制作1cm× 1cm的正方形切口;3.檢測(cè)指標(biāo):(1)組織形態(tài):術(shù)后第3, 5, 7, 9,11天取材,分別取傷口周圍0.5cm范圍內(nèi)的組織,HE染色觀察傷口再上皮化;(2)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn):術(shù)后第3, 5, 7, 9,11天取材,石蠟切片,免疫組化檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;(3)肉芽組織內(nèi)新生血管的數(shù)量:術(shù)后第3,5, 7, 9,11天取材,石蠟切片,免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;(4)膠原的染色:術(shù)后第5, 7, 9,11天取材,石蠟切片,Masson三色染色檢測(cè)傷口部位膠原的表達(dá);(5)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化:術(shù)后第3, 5, 7, 9, 11天取材,石蠟切片,免疫組化檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)標(biāo)記物K6和分化標(biāo)記物K1的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;(6)再上皮化過(guò)程中細(xì)胞增殖狀態(tài):術(shù)后第3, 5, 7, 9, 11天取材,石蠟切片,免疫組化Brdu標(biāo)記檢測(cè)新生表皮中的細(xì)胞增殖狀態(tài)和創(chuàng)口周圍的毛囊組織中細(xì)胞增殖,并分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;(6) MAPK信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子p-ERK,p-JNK,p-P38, p-ELK的表達(dá)情況,及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(7)Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子β-catenin,及粘附連接分子E-cadeherin的表達(dá)檢測(cè)。研究結(jié)果:1.組織形態(tài)觀察創(chuàng)面愈合速度:在光鏡水平觀察傷口再上皮化過(guò)程,HE染色可見:術(shù)后第3天WT組傷口邊緣角質(zhì)形成細(xì)胞增殖明顯且已經(jīng)開始向傷口中心遷移形成上皮帶(即再上皮化),KO組僅在傷口周圍出現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖反應(yīng),遷移形成上皮帶并不明顯。術(shù)后第5天WT組傷口周圍角質(zhì)形成細(xì)胞增殖形成細(xì)胞層數(shù)更多,遷移速度(即再上皮化速度)快于KO組,差異有顯著性;術(shù)后第7天WT組傷口已經(jīng)完成再上皮化,而KO組傷口部位到創(chuàng)后第9天才完成再上皮化,該結(jié)果提示角質(zhì)細(xì)胞敲除Cdc42延緩了創(chuàng)口角質(zhì)形成細(xì)胞的再上皮化,使得創(chuàng)面延遲愈合。2.檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果:(2)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn):經(jīng)免疫組化檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,可見創(chuàng)后第3天和第5天KO組F4/80陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著多于WT組(P≤0.05); (3)肉芽組織內(nèi)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量,免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31的表達(dá),統(tǒng)計(jì)分析,可見創(chuàng)后第5天、7天和9天創(chuàng)面新生血管數(shù)KO組與WT組差異無(wú)顯著性;(4)膠原的染色:Masson三色染色檢測(cè)傷口部位膠原的表達(dá),可見KO組膠原的合成較WT組少,分解較WT組慢;(5)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化:免疫組化檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)標(biāo)記物K6和分化標(biāo)記物K1的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,可見K6的表達(dá)在創(chuàng)后第3, 5, 7天KO組顯著低于WT組(P≤0.05); K1的表達(dá)在創(chuàng)后第5, 7天KO組顯著低于WT組(P≤0.05);(6)再上皮化過(guò)程中細(xì)胞增殖狀態(tài):免疫組化Brdu標(biāo)記檢測(cè)新生表皮中的細(xì)胞增殖狀態(tài)和創(chuàng)口周圍的毛囊組織中細(xì)胞增殖,并分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,可見新生表皮和創(chuàng)口周圍的毛囊組織中增殖細(xì)胞Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在創(chuàng)后第3,5, 7天KO組顯著少于WT組(P≤0.05); (6) MAPK信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子p-ERK,p-JNK, p-P38, p-ELK的表達(dá)情況,及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,可見在創(chuàng)緣新生表皮中p-ERK信號(hào)KO組顯著少于WT組(P≤0.05),其下游信號(hào)p-ELK的表達(dá)與p-ERK信號(hào)表達(dá)基本一致(P≤0.05)。(7)Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子β-catenin,及粘附連接分子E-cadeherin的表達(dá)檢測(cè),創(chuàng)后第3, 5,7天KO組可見胞質(zhì)高濃度表達(dá)的β-catenin,與β-catenin共同構(gòu)成粘附連接的E-cadeherin的表達(dá),與胞膜表達(dá)的β-catenin 一致。研究結(jié)論1、皮膚角質(zhì)細(xì)胞Cdc42的敲除延緩了皮膚創(chuàng)傷愈合,尤其是延遲了創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的再上皮化速度,這可能跟角質(zhì)細(xì)胞Cdc42基因敲除后,小鼠在第二個(gè)生長(zhǎng)期后毛囊bulge區(qū)毛囊干細(xì)胞的缺失有關(guān)。2、在信號(hào)機(jī)制方面角質(zhì)細(xì)胞Cdc42的基因敲除后,創(chuàng)傷修復(fù)再上皮化過(guò)程的延遲可能由MAPK信號(hào)家族中的ERK-ELK信號(hào)通路的介導(dǎo)完成。3、活化的Wnt/β-catenin信號(hào)通路也可能參與抑制了毛囊干細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞方向的分化,延緩了創(chuàng)傷修復(fù)中再上皮化速度。
【圖文】：

鼠生長(zhǎng)發(fā)育未見異常，全身毛發(fā)為黑色，無(wú)活動(dòng)及外觀異常，具有生育力。ＰＣＲ逡逑方法基因型鑒定結(jié)果為Ｋ５－Ｃｒｅ＋小鼠可見一條６６７ｂｐ特異條帶，Ｋ５－Ｃｒｅｖｊ、鼠ＰＣＲ逡逑結(jié)果為陰性，未見特異性條帶。ＰＣＲ方法基因型鑒定結(jié)果見：圖１－１，逡逑ｆｌ＂邋Ｉｆ逡逑圖１－１邋Ｋ５－Ｃｒｅ轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定。逡逑Ｆｉｇ邋１－１．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｋ５－Ｃｒｅ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｍｉｃｅ逡逑１．３．１．２邐純合子轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖、生長(zhǎng)發(fā)育及基因鑒定情況逡逑Ｃｄｃｕｌｏｘｐ／ｂｘｐ純合子轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖順利，其子代全身毛發(fā)均為黑色，外觀及活逡逑動(dòng)正常，具有生育能力。ＰＣＲ方法基因型鑒定結(jié)果為ＣｄＣ４２ｌ＜）ｘｐ／ｌ°ｘｐ純合子小鼠可逡逑見７００ｂｐ邋—條特異性條帶；雜合子小鼠可見６００ｂｐ和７００ｂｐ兩條特異逡逑性條帶。ＰＣＲ方法基因型鑒定結(jié)果見：圖１－２逡逑２０逡逑

逡逑圖１－２邋Ｃｄｃ４２Ｌｏｘｐ轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定逡逑Ｆｉｇ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｃｄｃ４２Ｌｏｘｐ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｍｉｃｅ逡逑１．３．１．３邋ＷＴ小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育及基因鑒定情況逡逑ＷＴ邋小鼠基因型為和邋Ｃｄｃ４２ｌＱｘｐ／＋／－Ｋ５－Ｃｒｅ－。ＷＴ邋小鼠出逡逑生后能夠正常發(fā)育長(zhǎng)大，成鼠全身毛發(fā)黑色，體型、大小、外觀及活動(dòng)均未見逡逑異常，具有生育能力。ＰＣＲ方法基因型鑒定結(jié)果見圖１－３Ａ逡逑圖１－３ＡＷＴ小鼠的基因型逡逑Ｆｉｇ邋１－３Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｗｉｌｄ邋ｔｙｐｅ邋ｍｏｕｓｅ逡逑ＰＣＲ電泳圖中１－８為同窩出生的小鼠編號(hào)，其中６號(hào)小鼠是基因型為逡逑？的邋ＷＴ邋小鼠，，５，７，８邋號(hào)小鼠是基因型為邋Ｃｄｃ４２ｌＱｘｐ／＋／－Ｋ５－Ｃｒｅ－逡逑的ＷＴ小鼠逡逑１．３．１．４雜合子小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育及鑒定情況逡逑雜合子小鼠基因型為Ｃｄｃ４２１°ｘｐ／＋／－Ｋ５－Ｃｒｅ＋，其表皮細(xì)胞Ｃｄｃ４２僅被半敲除，逡逑仍能夠表達(dá)Ｃｄｃ４２。雜合子小鼠出生后能夠正常發(fā)育長(zhǎng)大。雜合子小鼠全身毛發(fā)逡逑黑色，體型、大小、外觀及活動(dòng)均未見明顯異常，具有生育能力。ＰＣＲ方法基逡逑因型鑒定結(jié)果見圖１．３邋Ｂ：逡逑瞀：．逡逑２１逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R334.5

【參考文獻(xiàn)】

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2 熊昌艷;官大威;楊玫;趙銳;鄭吉龍;王玲;于天水;程子惠;胡更奕;朱寶利;;小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過(guò)程中p-JNK變化及其與時(shí)間的相關(guān)性[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2008年04期

3 付小兵,盛志勇;對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)[J];中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué);2002年07期

本文編號(hào)：2653291