【摘要】：毛發(fā)是皮膚重要的附屬結(jié)構(gòu),在個體中分布很廣,幾乎遍布全身。它除增加信息交流和美觀功能外,還具有具有防御、保護的作用。毛發(fā)位于皮下的部分被稱為毛囊,毛囊的組成和功能較為復雜,目前有研究認為:毛囊不僅能調(diào)控毛發(fā)的生長,其內(nèi)的干細胞還參與皮膚表皮細胞的更新和修復。毛囊是具有周期性生長特性的一種特殊器官,其周期分為生長期、退化期和靜止期。在靜止期,毛囊細胞受到某些因素的刺激,會再次進入生長期。通常毛發(fā)的生長和其周期變化涉及一系列多能上皮干細胞與其鄰近的間充質(zhì)細胞的相互作用,從間充質(zhì)細胞中發(fā)出的活化信號指導多能干細胞的遷移和分化,從而維持毛囊生長及其周期推進,如此周而復始在哺乳動物的整個生命期間循環(huán)往復。毛發(fā)的維持是毛囊以一種干細胞依賴的方式而進行的周期性再生。其周期性自我更新以及生長依賴于毛囊干細胞(hair follicle stem cells,HFSCs)周期性增殖和分化。如果毛囊各周期轉(zhuǎn)換中的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題,就可能會影響毛囊的生長,進而出現(xiàn)毛囊相關(guān)疾病,例如脫發(fā)、斑禿等。毛囊干細胞是毛囊中的原始細胞,主要存在于毛囊外根鞘隆突部中bulge區(qū),也是皮膚干細胞的所在地之一。其通過自我更新維持毛囊周期循環(huán)、表皮新陳代謝,有文獻認為它還參與了皮膚創(chuàng)傷愈合,能源源不斷地為表皮基底層提供干細胞。目前,bulge區(qū)是毛囊干細胞主要棲息地的學說已經(jīng)得到普遍認同。Cdc42是小G蛋白Rho家族蛋白中的重要成員,體內(nèi)的Cdc42有兩種形式,即GDP結(jié)合的無活性狀態(tài)與GTP結(jié)合的活性狀態(tài)。Cdc42在細胞信號轉(zhuǎn)導通路中具有分子開關(guān)作用。活化的Cdc42通過作用于細胞內(nèi)一系列下游效應(yīng)底物來影響細胞的生長、分化、凋亡和細胞周期等一系列重要生命現(xiàn)象,其最重要的功能是調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架重組。近期研究發(fā)現(xiàn),小G蛋白Rho家族成員對角質(zhì)形成細胞的增殖、分化和凋亡具有重要調(diào)控作用。本課題組前期研究揭示RhoA可以通過MEKK1/JNK信號通路調(diào)控角質(zhì)形成細胞的增殖與分化,促進皮膚創(chuàng)傷愈合。我們利用引進的Cdc42Loxp/Loxp小鼠和K5/Cre~+小鼠,依據(jù)Cre/loxp重組酶系統(tǒng)原理(1)建立皮膚角質(zhì)細胞特異性Cdc42基因敲除小鼠。(2)探討Cdc42對皮膚及毛囊發(fā)育的影響。(3)進一步探討Cdc42對皮膚創(chuàng)傷愈合的影響及可能參與的相關(guān)信號機制,從而為研究和治療脫發(fā)相關(guān)疾病及皮膚的創(chuàng)傷修復作用及機制提供理論基礎(chǔ)。第一章皮膚角質(zhì)細胞特異性Cdc42基因敲除小鼠模型的建立及對小鼠毛囊干細胞的影響研究背景和目的由于以往對Cdc42的研究大多局限于細胞水平,后發(fā)現(xiàn)Cre/loxp重組酶系統(tǒng)后,實現(xiàn)了在動物體內(nèi)進行條件性基因敲除,即實現(xiàn)目的基因在動物體內(nèi)特定組織及特定時間內(nèi)的敲除。目前,條件基因敲除動物已經(jīng)成為用于研究某個特定基因在動物體內(nèi)特定部位功能的較好的動物模型。Cre/loxp條件性基因敲除技術(shù)是目前國際上最先進的基因敲除技術(shù),廣泛用于動物體內(nèi)目的基因作用的研究。角蛋白5 (keratin5,K5)是皮膚表皮層的角質(zhì)細胞表達的一種角蛋白。正常情況下,K5和K14二者成對表達,是角質(zhì)形成細胞分化的標志物之一。本研究選用角蛋白5(K5)基因為啟動子,用它引導和限定Cre重組酶基因在角質(zhì)細胞中表達,以獲得皮膚角質(zhì)細胞特異性表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠,為應(yīng)用Cre/loxp系統(tǒng)研究目的基因在皮膚的發(fā)生、發(fā)育等及皮膚附屬器的形成和功能中的作用創(chuàng)造條件。毛發(fā)由毛囊生成,毛囊細胞呈周期性生長,如果毛囊各周期轉(zhuǎn)換中的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題,就可能會影響毛發(fā)的生長,進而出現(xiàn)毛發(fā)相關(guān)疾病。毛發(fā)的維持是毛囊以一種干細胞依賴的方式而進行的周期性再生。其周期性自我更新以及生長依賴于毛囊干細胞(hair follicle stem cells, HFSCs)周期性增殖和分化。毛囊干細胞是毛囊中的原始細胞,主要存在于毛囊外根鞘隆突部中bulge區(qū),有文獻認為bulge區(qū)也是皮膚干細胞的所在地之一。本研究利用Cre/loxp系統(tǒng)的條件性基因敲除原理為理論基礎(chǔ),利用Cdc42Loxp/Loxp轉(zhuǎn)基因小鼠和K5-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠,構(gòu)建皮膚角質(zhì)細胞特異性Cdc42基因敲除小鼠,探討Cdc42在毛發(fā)周期循環(huán)以及對毛囊干細胞的生物學功能影響的作用。研究方法1.利用Cre/loxp重組酶系統(tǒng),將Cdc42loxp/loxp小鼠和K5-Cre~+/-轉(zhuǎn)基因小鼠進行雜交,其F1代小鼠中基因型分別為Cdc42loxp/+/-K5-Cre~+和Cdc42loxp/+/-K5-Cre-。而后利用 Cdc42lopx+/-K5-Cre~+/-小鼠與 Cdc42loxp/loxp 小鼠雜交,其后代獲取1/4比例在角質(zhì)細胞上敲除Cdc42的小鼠,簡稱KO小鼠,基因型為Cdc42loxp/loxp/-K5-Cre~+;獲取1/2比例Cdc42未敲除(野生型)小鼠,簡稱 WT 小鼠,基因型為 Cdc42loxp/+/K5-Cre-或 Cc42loxp/loxp/-K5-Cre-。通過PCR方法和Cdc42免疫組織化學方法進行基因水平和蛋白水平鑒定。按照準確的日齡觀察出生后的KO小鼠和WT小鼠發(fā)育及皮膚和毛囊的大體發(fā)育;取出生后24天(P24天)～出生后70天(P70天)的KO小鼠和WT小鼠皮膚,將取材的皮膚放入4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片和染色。2.檢測指標:(1)大體觀察:大體觀察KO小鼠和WT小鼠皮膚和毛發(fā)的外觀和完整性,重點觀察毛發(fā)的周期性變化差異;(2)組織形態(tài):利用HE染色觀察處于毛發(fā)生長周期不同階段KO小鼠和WT小鼠毛囊組織的變化及差異;(3) KO小鼠和WT小鼠在毛發(fā)生長發(fā)育有差異的時間點進行毛囊干細胞表面標記物K15的檢測和比較,以明確皮膚角質(zhì)細胞Cdc42基因敲除對毛囊干細胞維持和穩(wěn)定的影響;(4)利用脫毛誘導刺激毛囊干細胞增殖實驗,檢測Cdc42基因敲除對毛囊干細胞動員和增殖的影響。研究結(jié)果:1. PCR基因鑒定,K5-Cre~+為667bp特異條帶,Cdc42loxp/loxp為700bp特異性條帶,WT為600bp特異性條帶。K5-Cre~+且Cdc42loxp/loxp的小鼠為KO小鼠,基因型為Cdc42loxp/loxp-K5-Cre~+。皮膚表皮細胞的Cdc42免疫組化染色,未見KO小鼠皮膚角質(zhì)細胞內(nèi)Cdc42蛋白的表達,說明成功構(gòu)成皮膚角質(zhì)細胞Cdc42基因敲除小鼠。2.大體觀察結(jié)果:KO小鼠體型、大小及皮膚完整性等與WT小鼠比較無差別。P49天以前KO小鼠與WT小鼠相比毛發(fā)在萌出、萌出后的外觀、密度、長度方面無差異。但P49天后KO小鼠出現(xiàn)進行性由頭端向尾端的脫毛,至P64天左右,與對照WT小鼠相比,全身毛發(fā)明顯稀疏,之后無再生跡象,毛發(fā)周期性循環(huán)消失。3.組織形態(tài)觀察:KO小鼠出現(xiàn)脫毛表型后,其毛發(fā)的周期性循環(huán)消失,永久停留在靜止期。4.指標檢測:免疫組化K15檢測發(fā)現(xiàn):在P49天后,KO小鼠皮膚毛囊干細胞(bulge區(qū))明顯減少甚至耗竭消失。KO小鼠毛囊從第二個靜止期無法正常進入第三個生長期,KO小鼠毛囊干細胞的自然增殖能力減弱甚至消失。脫毛刺激后,KO小鼠毛囊干細胞動員能力明顯減弱甚至消失;脫毛后10天,KO小鼠毛干萌出障礙。研究結(jié)論1、成功構(gòu)建皮膚角質(zhì)細胞特異性Cdc42基因敲除小鼠,并發(fā)現(xiàn):Cdc42基因敲除小鼠毛發(fā)在出生后49天逐漸出現(xiàn)進行性脫落,毛發(fā)周期性循環(huán)消失。2、角質(zhì)細胞特異性Cdc42基因敲除小鼠在出生后49天,K15標記的毛囊bulge區(qū)干細胞逐漸缺失,證明:Cdc42對毛囊干細胞的維持有促進作用。3、伴隨著K15標記的毛囊bulge區(qū)干細胞的缺失,Cdc42基因敲除小鼠毛囊干細胞的自然增殖和刺激后增殖能力減弱,毛發(fā)無法再生。說明:Cdc42對毛囊干細胞的動員和增殖能力有促進作用。第二章角質(zhì)細胞Cdc42基因敲除對小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響研究背景和目的皮膚是機體最大的器官,其首要功能是將機體組織隔絕外界環(huán)境起到保護屏障的作用。由于創(chuàng)傷、燒傷、感染、腫瘤和代謝疾病等造成的皮膚損傷在臨床上十分常見。皮膚的創(chuàng)傷修復也是目前研究的熱點。皮膚創(chuàng)傷愈合是個非常復雜的過程,涉及多種細胞、多個信號機制參與。愈合包括表皮和真皮的再生,表皮再生即是皮膚再上皮化(re-epithelialization)。創(chuàng)傷愈合過程中創(chuàng)口的再上皮化過程非常重要,上皮化延遲會導致傷口纖維化加重,產(chǎn)生明顯瘢痕組織。再上皮化過程中,主要由創(chuàng)口周圍表皮基底層表皮干細胞及創(chuàng)口附近表皮的附屬器中的表皮干細胞向傷口分化、增殖進行修復。近年來,越來越多的研究傾向于研究再上皮化過程中毛囊干細胞發(fā)揮的作用,甚至有研究認為,毛囊干細胞強大的分裂增殖潛能為干細胞移植帶來了希望。創(chuàng)傷的愈合過程是人體最復雜的生物過程之一,在人體受到各種傷害之后,各種各樣的生物信號途徑迅速激活并在此修復過程中發(fā)揮不同的作用。如:絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)是介導細胞生物學應(yīng)答的重要信號系統(tǒng)。JNK, ERK, p38是MAPK家族主要成員,調(diào)節(jié)一系列生理病理生物學活動。Wnt信號通路與皮膚的生長發(fā)育、毛囊的周期再生以及創(chuàng)面的功能修復等生物學過程均有密切關(guān)系。研究證明Wnt信號途徑的激活是對創(chuàng)傷刺激的一種特殊反應(yīng)。而β-catenin是Wnt信號通路的關(guān)鍵作用因子。角質(zhì)細胞Cdc42基因敲除后導致小鼠出現(xiàn)一系列毛囊發(fā)育障礙,包括進行性脫毛,毛囊周期性循環(huán)消失,毛囊干細胞缺失。為進一步探討皮膚角質(zhì)細胞Cdc42基因敲除對皮膚創(chuàng)傷修復的影響以及由于Cdc42基因敲除造成的毛囊發(fā)育異常尤其是毛囊干細胞的異常對皮膚創(chuàng)傷修復的影響及其作用機制,我們進行了皮膚創(chuàng)傷修復實驗。研究方法1.分組:Control組(野生型小鼠,WT小鼠)2. 實驗組(角質(zhì)細胞Cdc42基因敲除小鼠,KO小鼠)創(chuàng)傷模型:7-8周齡Cdc42基因敲除小鼠和同窩出生的野生型小鼠,背部右側(cè)制作1cm× 1cm的正方形切口;3.檢測指標:(1)組織形態(tài):術(shù)后第3, 5, 7, 9,11天取材,分別取傷口周圍0.5cm范圍內(nèi)的組織,HE染色觀察傷口再上皮化;(2)巨噬細胞浸潤:術(shù)后第3, 5, 7, 9,11天取材,石蠟切片,免疫組化檢測巨噬細胞標記物F4/80的表達,并進行統(tǒng)計分析;(3)肉芽組織內(nèi)新生血管的數(shù)量:術(shù)后第3,5, 7, 9,11天取材,石蠟切片,免疫組化檢測血管內(nèi)皮細胞標記物CD31的表達,并進行統(tǒng)計分析;(4)膠原的染色:術(shù)后第5, 7, 9,11天取材,石蠟切片,Masson三色染色檢測傷口部位膠原的表達;(5)角質(zhì)形成細胞的增殖和分化:術(shù)后第3, 5, 7, 9, 11天取材,石蠟切片,免疫組化檢測角質(zhì)形成細胞進入增殖狀態(tài)標記物K6和分化標記物K1的表達,并進行統(tǒng)計分析;(6)再上皮化過程中細胞增殖狀態(tài):術(shù)后第3, 5, 7, 9, 11天取材,石蠟切片,免疫組化Brdu標記檢測新生表皮中的細胞增殖狀態(tài)和創(chuàng)口周圍的毛囊組織中細胞增殖,并分別進行統(tǒng)計分析;(6) MAPK信號通路相關(guān)信號分子p-ERK,p-JNK,p-P38, p-ELK的表達情況,及統(tǒng)計學分析。(7)Wnt信號通路的關(guān)鍵信號分子β-catenin,及粘附連接分子E-cadeherin的表達檢測。研究結(jié)果:1.組織形態(tài)觀察創(chuàng)面愈合速度:在光鏡水平觀察傷口再上皮化過程,HE染色可見:術(shù)后第3天WT組傷口邊緣角質(zhì)形成細胞增殖明顯且已經(jīng)開始向傷口中心遷移形成上皮帶(即再上皮化),KO組僅在傷口周圍出現(xiàn)角質(zhì)形成細胞增殖反應(yīng),遷移形成上皮帶并不明顯。術(shù)后第5天WT組傷口周圍角質(zhì)形成細胞增殖形成細胞層數(shù)更多,遷移速度(即再上皮化速度)快于KO組,差異有顯著性;術(shù)后第7天WT組傷口已經(jīng)完成再上皮化,而KO組傷口部位到創(chuàng)后第9天才完成再上皮化,該結(jié)果提示角質(zhì)細胞敲除Cdc42延緩了創(chuàng)口角質(zhì)形成細胞的再上皮化,使得創(chuàng)面延遲愈合。2.檢測指標結(jié)果:(2)巨噬細胞浸潤:經(jīng)免疫組化檢測巨噬細胞標記物F4/80的表達,并進行統(tǒng)計分析,可見創(chuàng)后第3天和第5天KO組F4/80陽性細胞數(shù)顯著多于WT組(P≤0.05); (3)肉芽組織內(nèi)新生血管內(nèi)皮細胞的數(shù)量,免疫組化檢測血管內(nèi)皮細胞標記物CD31的表達,統(tǒng)計分析,可見創(chuàng)后第5天、7天和9天創(chuàng)面新生血管數(shù)KO組與WT組差異無顯著性;(4)膠原的染色:Masson三色染色檢測傷口部位膠原的表達,可見KO組膠原的合成較WT組少,分解較WT組慢;(5)角質(zhì)形成細胞的增殖和分化:免疫組化檢測角質(zhì)形成細胞進入增殖狀態(tài)標記物K6和分化標記物K1的表達,并進行統(tǒng)計分析,可見K6的表達在創(chuàng)后第3, 5, 7天KO組顯著低于WT組(P≤0.05); K1的表達在創(chuàng)后第5, 7天KO組顯著低于WT組(P≤0.05);(6)再上皮化過程中細胞增殖狀態(tài):免疫組化Brdu標記檢測新生表皮中的細胞增殖狀態(tài)和創(chuàng)口周圍的毛囊組織中細胞增殖,并分別進行統(tǒng)計分析,可見新生表皮和創(chuàng)口周圍的毛囊組織中增殖細胞Brdu陽性細胞數(shù)在創(chuàng)后第3,5, 7天KO組顯著少于WT組(P≤0.05); (6) MAPK信號通路相關(guān)信號分子p-ERK,p-JNK, p-P38, p-ELK的表達情況,及統(tǒng)計學分析,可見在創(chuàng)緣新生表皮中p-ERK信號KO組顯著少于WT組(P≤0.05),其下游信號p-ELK的表達與p-ERK信號表達基本一致(P≤0.05)。(7)Wnt信號通路的關(guān)鍵信號分子β-catenin,及粘附連接分子E-cadeherin的表達檢測,創(chuàng)后第3, 5,7天KO組可見胞質(zhì)高濃度表達的β-catenin,與β-catenin共同構(gòu)成粘附連接的E-cadeherin的表達,與胞膜表達的β-catenin 一致。研究結(jié)論1、皮膚角質(zhì)細胞Cdc42的敲除延緩了皮膚創(chuàng)傷愈合,尤其是延遲了創(chuàng)傷愈合過程中的再上皮化速度,這可能跟角質(zhì)細胞Cdc42基因敲除后,小鼠在第二個生長期后毛囊bulge區(qū)毛囊干細胞的缺失有關(guān)。2、在信號機制方面角質(zhì)細胞Cdc42的基因敲除后,創(chuàng)傷修復再上皮化過程的延遲可能由MAPK信號家族中的ERK-ELK信號通路的介導完成。3、活化的Wnt/β-catenin信號通路也可能參與抑制了毛囊干細胞向角質(zhì)形成細胞方向的分化,延緩了創(chuàng)傷修復中再上皮化速度。
【圖文】：

鼠生長發(fā)育未見異常，全身毛發(fā)為黑色，無活動及外觀異常，具有生育力。ＰＣＲ逡逑方法基因型鑒定結(jié)果為Ｋ５－Ｃｒｅ＋小鼠可見一條６６７ｂｐ特異條帶，Ｋ５－Ｃｒｅｖｊ、鼠ＰＣＲ逡逑結(jié)果為陰性，未見特異性條帶。ＰＣＲ方法基因型鑒定結(jié)果見：圖１－１，逡逑ｆｌ＂邋Ｉｆ逡逑圖１－１邋Ｋ５－Ｃｒｅ轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定。逡逑Ｆｉｇ邋１－１．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｋ５－Ｃｒｅ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｍｉｃｅ逡逑１．３．１．２邐純合子轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖、生長發(fā)育及基因鑒定情況逡逑Ｃｄｃｕｌｏｘｐ／ｂｘｐ純合子轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖順利，其子代全身毛發(fā)均為黑色，外觀及活逡逑動正常，具有生育能力。ＰＣＲ方法基因型鑒定結(jié)果為ＣｄＣ４２ｌ＜）ｘｐ／ｌ°ｘｐ純合子小鼠可逡逑見７００ｂｐ邋—條特異性條帶；雜合子小鼠可見６００ｂｐ和７００ｂｐ兩條特異逡逑性條帶。ＰＣＲ方法基因型鑒定結(jié)果見：圖１－２逡逑２０逡逑

逡逑圖１－２邋Ｃｄｃ４２Ｌｏｘｐ轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定逡逑Ｆｉｇ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｃｄｃ４２Ｌｏｘｐ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｍｉｃｅ逡逑１．３．１．３邋ＷＴ小鼠的生長發(fā)育及基因鑒定情況逡逑ＷＴ邋小鼠基因型為和邋Ｃｄｃ４２ｌＱｘｐ／＋／－Ｋ５－Ｃｒｅ－。ＷＴ邋小鼠出逡逑生后能夠正常發(fā)育長大，成鼠全身毛發(fā)黑色，體型、大小、外觀及活動均未見逡逑異常，具有生育能力。ＰＣＲ方法基因型鑒定結(jié)果見圖１－３Ａ逡逑圖１－３ＡＷＴ小鼠的基因型逡逑Ｆｉｇ邋１－３Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｗｉｌｄ邋ｔｙｐｅ邋ｍｏｕｓｅ逡逑ＰＣＲ電泳圖中１－８為同窩出生的小鼠編號，其中６號小鼠是基因型為逡逑？的邋ＷＴ邋小鼠，，５，７，８邋號小鼠是基因型為邋Ｃｄｃ４２ｌＱｘｐ／＋／－Ｋ５－Ｃｒｅ－逡逑的ＷＴ小鼠逡逑１．３．１．４雜合子小鼠的生長發(fā)育及鑒定情況逡逑雜合子小鼠基因型為Ｃｄｃ４２１°ｘｐ／＋／－Ｋ５－Ｃｒｅ＋，其表皮細胞Ｃｄｃ４２僅被半敲除，逡逑仍能夠表達Ｃｄｃ４２。雜合子小鼠出生后能夠正常發(fā)育長大。雜合子小鼠全身毛發(fā)逡逑黑色，體型、大小、外觀及活動均未見明顯異常，具有生育能力。ＰＣＲ方法基逡逑因型鑒定結(jié)果見圖１．３邋Ｂ：逡逑瞀：．逡逑２１逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R334.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 倪振洪;邵勇;李玉紅;;毛囊干細胞標記物的研究進展[J];中國細胞生物學學報;2010年01期

2 熊昌艷;官大威;楊玫;趙銳;鄭吉龍;王玲;于天水;程子惠;胡更奕;朱寶利;;小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中p-JNK變化及其與時間的相關(guān)性[J];法醫(yī)學雜志;2008年04期

3 付小兵,盛志勇;對創(chuàng)傷修復中信號轉(zhuǎn)導機制的認識[J];中國危重病急救醫(yī)學;2002年07期

本文編號：2653291