發(fā)布時(shí)間：2020-05-02 19:06

【摘要】：研究背景及研究目的:大量臨床觀察和基因修飾動(dòng)物模型資料顯示,心血管表型具有顯著的性別差異。一般認(rèn)為,雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用,而雄激素則可加重心血管系統(tǒng)的損傷。然而,在對(duì)婦女絕經(jīng)后綜合征進(jìn)行大規(guī)模激素替代療法的臨床觀察表明,雌激素替代療法不僅可導(dǎo)致體內(nèi)激素水平失衡,同時(shí)還有增加心血管疾病以及女性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。目前,對(duì)這種不同性別所致的心血管表型差異的分子機(jī)制研究?jī)H限于性激素對(duì)靶器官的作用,其分子機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。我們?cè)l(fā)現(xiàn)FKBP12.6基因敲除(FKBP12.6-/-)后僅雄性小鼠發(fā)生心肌肥大,CD38基因敲除(CD38~(-/-))后僅雄性小鼠心功能增強(qiáng),我們還觀察到CD38~(-/-)小鼠血清睪酮,雌二醇和LH水平上調(diào)。我們推測(cè)FKBP12.6和CD38基因修飾可能通過(guò)上調(diào)了中樞下丘腦-腺垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis:HPGs)而發(fā)揮作用,但具體機(jī)制還不明確。因此,我們提出假說(shuō):各種原因?qū)е碌腍PGs激活是引起性別相關(guān)心血管表型差異的主要原因。本研究旨在以FKBP12.6和CD38基因敲除小鼠作為基因修飾動(dòng)物模型,深入探討下丘腦-腺垂體-性腺軸對(duì)基因修飾小鼠所致心血管表型差異的調(diào)控作用及其機(jī)制,同時(shí),我們以新近制備的Tet-on誘導(dǎo)性下丘腦特異性表達(dá)Gn RH1轉(zhuǎn)基因小鼠驗(yàn)證我們的假說(shuō)。實(shí)驗(yàn)方法:1.為了明確FKBP12.6缺失對(duì)心臟的直接作用,我們首先檢測(cè)FKBP12.6-/-小鼠心臟鈣離子相關(guān)通路蛋白Ca MKⅡ和Calcineurin(Ca N)、MCIP1、MCIP1.4、雄激素受體和雌激素受體的表達(dá)變化。2.為了明確性激素在雄性FKBP12.6-/-小鼠心肌肥大中的作用,我們首先將雄性小鼠睪丸摘除觀察小鼠心臟體重比變化。同時(shí)采用放免法(RIA)和ELISA法檢測(cè)FKBP12.6-/-小鼠睪酮、雌二醇、LH和FSH分泌水平。3.為了明確FKBP12.6-/-對(duì)HPGs的調(diào)控部位,我們采用RT-QPCR和western blot法比較了垂體神經(jīng)元細(xì)胞LβT2和下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞GT1-7中FKBP12.6的表達(dá),觀察FKBP12.6干擾后GT1-7細(xì)胞中Gn RH1的表達(dá)變化和LβT2細(xì)胞中LHβ、Nur77、SF-1的表達(dá)變化。同時(shí)采用Fluo-3鈣離子探針檢測(cè)LβT2細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化,最后western blot檢測(cè)LβT2細(xì)胞胞漿胞核中Ca N/NFAT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化(ERK1/2、Ca N、MCIP1.4 Nur77、NFAT3、Pin1)。4.Sirt1被證明可調(diào)控HPGs的功能,為了明確Sirt1在CD38~(-/-)小鼠下丘腦中的作用機(jī)制,我們采用RT-PCR和western blot檢測(cè)GT1-7細(xì)胞中CD38干擾并加入Sirt1抑制劑EX527后,Sirt1、Ac-P53、Gn RH1及其轉(zhuǎn)錄因子Otx2的蛋白表達(dá)變化。5.為了驗(yàn)證我們的假說(shuō),即各種原因?qū)е碌腍PGs激活是引起性別相關(guān)的心血管表型差異的主要原因,我們制備了Tet-on誘導(dǎo)性下丘腦特異性Gn RH1轉(zhuǎn)基因小鼠。當(dāng)小鼠成年后給予DOX可誘導(dǎo)小鼠下丘腦特異性Gn RH1過(guò)表達(dá);免疫熒光染色和western blot檢測(cè)Gn RH1在轉(zhuǎn)基因小鼠下丘腦中的表達(dá)。小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)不同性別小鼠心功能變化,western blot法檢測(cè)雄激素促心肌肥大通路m TOR的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.FKBP12.6-/-小鼠心臟蛋白檢測(cè)結(jié)果表明,Ca MKⅡ的磷酸化水平與野生型小鼠無(wú)差異,雄性小鼠MCIP1.4表達(dá)上調(diào),雌性小鼠MCIP1表達(dá)上調(diào),表明雄性小鼠Ca N活性增強(qiáng),雌性小鼠Ca N活性被抑制。2.FKBP12.6-/-雄性小鼠睪丸摘除后不發(fā)生心肌肥大,表明雄激素在雄性FKBP12.6-/-小鼠心肌肥大中起重要作用。FKBP12.6-/-敲除小鼠性激素水平上調(diào)。表明FKBP12.6-/-敲除小鼠下丘腦-腺垂體-性腺軸功能上調(diào)。3.FKBP12.6在LβT2表達(dá)遠(yuǎn)高于GT1-7。siRNA干擾FKBP12.6并不影響GT1-7細(xì)胞中Gn RH1表達(dá)。表明FKBP12.6對(duì)下丘腦-腺垂體-性腺軸的調(diào)控部位可能在垂體。4.FKBP12.6干擾后LβT2細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升,Ca N、MCIP1.4、SERCA2、LHβ、Nur77、SF-1等m RNA表達(dá)增加,胞漿中Ca N、MCIP1.4蛋白和ERK1/2磷酸化水平,胞核Nur77、NFAT3、Pin1蛋白和Pin1磷酸化水平上調(diào)。表明FKBP12.6缺失通過(guò)Ca N/NFAT3途徑調(diào)控垂體LHβ和FSHβ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。5.CD38干擾后GT1-7細(xì)胞GnRH1 mRNA的表達(dá)增加,Sirt1抑制劑EX527可逆轉(zhuǎn)CD38干擾后Gn RH1前體蛋白及其轉(zhuǎn)錄因子Otx2表達(dá)的上調(diào)。表明CD38通過(guò)改變Sirt1活性調(diào)控Gn RH1的表達(dá)。6.DOX誘導(dǎo)后小鼠下丘腦組織中Gn RH1前體蛋白表達(dá)上調(diào),血清中Gn RH1和FSH分泌增加,表明Gn RH1成功在小鼠下丘腦特異性過(guò)表達(dá),小鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示雄性轉(zhuǎn)基因小鼠在誘導(dǎo)30天和60天后IVS厚度和左心室重量增加,雌性小鼠無(wú)明顯改變,表明Gn RH1轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生性別差異性心肌肥大。雄性小鼠心臟m TOR的磷酸化水平上調(diào),表明雄激素促心肌肥大通路m TOR被激活。結(jié)論敲除FKBP12.6或CD38基因可分別通過(guò)激活腦垂體Ca N/NFAT3或下丘腦Sirt1信號(hào)途徑,增強(qiáng)下丘腦-腺垂體-性腺軸的功能,進(jìn)而引起小鼠體內(nèi)性激素水平上調(diào)(如雄激素水平升高,雌激素水平相對(duì)降低),導(dǎo)致敲除小鼠性別差異性心血管表型。DOX誘導(dǎo)成年小鼠Gn RH1在小鼠下丘腦特異性表達(dá),可直接導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生性別差異性心血管表型如心肌肥大等。因此,我們首次證明,下丘腦-腺垂體-性腺軸的調(diào)控改變是產(chǎn)生性別相關(guān)心血管表型差異的主要原因。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R-332;R54

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Wenjie Wei;Richard Graeff;Jianbo Yue;;Roles and mechanisms of the CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose/Ca~(2+) signaling pathway[J];World Journal of Biological Chemistry;2014年01期

2 ;Abrupt changes in FKBP12.6 and SERCA2a expression contribute to sudden occurrence of ventricular fibrillation on reperfusion and are prevented by CPU86017[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年06期

，

本文編號(hào)：2647398