【摘要】：研究背景及研究目的:大量臨床觀察和基因修飾動物模型資料顯示,心血管表型具有顯著的性別差異。一般認為,雌激素對心血管系統(tǒng)具有保護作用,而雄激素則可加重心血管系統(tǒng)的損傷。然而,在對婦女絕經(jīng)后綜合征進行大規(guī)模激素替代療法的臨床觀察表明,雌激素替代療法不僅可導(dǎo)致體內(nèi)激素水平失衡,同時還有增加心血管疾病以及女性腫瘤的風(fēng)險。目前,對這種不同性別所致的心血管表型差異的分子機制研究僅限于性激素對靶器官的作用,其分子機制還遠未闡明。我們曾發(fā)現(xiàn)FKBP12.6基因敲除(FKBP12.6-/-)后僅雄性小鼠發(fā)生心肌肥大,CD38基因敲除(CD38~(-/-))后僅雄性小鼠心功能增強,我們還觀察到CD38~(-/-)小鼠血清睪酮,雌二醇和LH水平上調(diào)。我們推測FKBP12.6和CD38基因修飾可能通過上調(diào)了中樞下丘腦-腺垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis:HPGs)而發(fā)揮作用,但具體機制還不明確。因此,我們提出假說:各種原因?qū)е碌腍PGs激活是引起性別相關(guān)心血管表型差異的主要原因。本研究旨在以FKBP12.6和CD38基因敲除小鼠作為基因修飾動物模型,深入探討下丘腦-腺垂體-性腺軸對基因修飾小鼠所致心血管表型差異的調(diào)控作用及其機制,同時,我們以新近制備的Tet-on誘導(dǎo)性下丘腦特異性表達Gn RH1轉(zhuǎn)基因小鼠驗證我們的假說。實驗方法:1.為了明確FKBP12.6缺失對心臟的直接作用,我們首先檢測FKBP12.6-/-小鼠心臟鈣離子相關(guān)通路蛋白Ca MKⅡ和Calcineurin(Ca N)、MCIP1、MCIP1.4、雄激素受體和雌激素受體的表達變化。2.為了明確性激素在雄性FKBP12.6-/-小鼠心肌肥大中的作用,我們首先將雄性小鼠睪丸摘除觀察小鼠心臟體重比變化。同時采用放免法(RIA)和ELISA法檢測FKBP12.6-/-小鼠睪酮、雌二醇、LH和FSH分泌水平。3.為了明確FKBP12.6-/-對HPGs的調(diào)控部位,我們采用RT-QPCR和western blot法比較了垂體神經(jīng)元細胞LβT2和下丘腦神經(jīng)元細胞GT1-7中FKBP12.6的表達,觀察FKBP12.6干擾后GT1-7細胞中Gn RH1的表達變化和LβT2細胞中LHβ、Nur77、SF-1的表達變化。同時采用Fluo-3鈣離子探針檢測LβT2細胞內(nèi)鈣離子濃度變化,最后western blot檢測LβT2細胞胞漿胞核中Ca N/NFAT通路相關(guān)蛋白的表達變化(ERK1/2、Ca N、MCIP1.4 Nur77、NFAT3、Pin1)。4.Sirt1被證明可調(diào)控HPGs的功能,為了明確Sirt1在CD38~(-/-)小鼠下丘腦中的作用機制,我們采用RT-PCR和western blot檢測GT1-7細胞中CD38干擾并加入Sirt1抑制劑EX527后,Sirt1、Ac-P53、Gn RH1及其轉(zhuǎn)錄因子Otx2的蛋白表達變化。5.為了驗證我們的假說,即各種原因?qū)е碌腍PGs激活是引起性別相關(guān)的心血管表型差異的主要原因,我們制備了Tet-on誘導(dǎo)性下丘腦特異性Gn RH1轉(zhuǎn)基因小鼠。當小鼠成年后給予DOX可誘導(dǎo)小鼠下丘腦特異性Gn RH1過表達;免疫熒光染色和western blot檢測Gn RH1在轉(zhuǎn)基因小鼠下丘腦中的表達。小動物超聲儀檢測不同性別小鼠心功能變化,western blot法檢測雄激素促心肌肥大通路m TOR的磷酸化水平。實驗結(jié)果:1.FKBP12.6-/-小鼠心臟蛋白檢測結(jié)果表明,Ca MKⅡ的磷酸化水平與野生型小鼠無差異,雄性小鼠MCIP1.4表達上調(diào),雌性小鼠MCIP1表達上調(diào),表明雄性小鼠Ca N活性增強,雌性小鼠Ca N活性被抑制。2.FKBP12.6-/-雄性小鼠睪丸摘除后不發(fā)生心肌肥大,表明雄激素在雄性FKBP12.6-/-小鼠心肌肥大中起重要作用。FKBP12.6-/-敲除小鼠性激素水平上調(diào)。表明FKBP12.6-/-敲除小鼠下丘腦-腺垂體-性腺軸功能上調(diào)。3.FKBP12.6在LβT2表達遠高于GT1-7。siRNA干擾FKBP12.6并不影響GT1-7細胞中Gn RH1表達。表明FKBP12.6對下丘腦-腺垂體-性腺軸的調(diào)控部位可能在垂體。4.FKBP12.6干擾后LβT2細胞內(nèi)鈣離子濃度上升,Ca N、MCIP1.4、SERCA2、LHβ、Nur77、SF-1等m RNA表達增加,胞漿中Ca N、MCIP1.4蛋白和ERK1/2磷酸化水平,胞核Nur77、NFAT3、Pin1蛋白和Pin1磷酸化水平上調(diào)。表明FKBP12.6缺失通過Ca N/NFAT3途徑調(diào)控垂體LHβ和FSHβ的轉(zhuǎn)錄表達。5.CD38干擾后GT1-7細胞GnRH1 mRNA的表達增加,Sirt1抑制劑EX527可逆轉(zhuǎn)CD38干擾后Gn RH1前體蛋白及其轉(zhuǎn)錄因子Otx2表達的上調(diào)。表明CD38通過改變Sirt1活性調(diào)控Gn RH1的表達。6.DOX誘導(dǎo)后小鼠下丘腦組織中Gn RH1前體蛋白表達上調(diào),血清中Gn RH1和FSH分泌增加,表明Gn RH1成功在小鼠下丘腦特異性過表達,小鼠超聲心動圖結(jié)果顯示雄性轉(zhuǎn)基因小鼠在誘導(dǎo)30天和60天后IVS厚度和左心室重量增加,雌性小鼠無明顯改變,表明Gn RH1轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生性別差異性心肌肥大。雄性小鼠心臟m TOR的磷酸化水平上調(diào),表明雄激素促心肌肥大通路m TOR被激活。結(jié)論敲除FKBP12.6或CD38基因可分別通過激活腦垂體Ca N/NFAT3或下丘腦Sirt1信號途徑,增強下丘腦-腺垂體-性腺軸的功能,進而引起小鼠體內(nèi)性激素水平上調(diào)(如雄激素水平升高,雌激素水平相對降低),導(dǎo)致敲除小鼠性別差異性心血管表型。DOX誘導(dǎo)成年小鼠Gn RH1在小鼠下丘腦特異性表達,可直接導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生性別差異性心血管表型如心肌肥大等。因此,我們首次證明,下丘腦-腺垂體-性腺軸的調(diào)控改變是產(chǎn)生性別相關(guān)心血管表型差異的主要原因。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R-332;R54

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Wenjie Wei;Richard Graeff;Jianbo Yue;;Roles and mechanisms of the CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose/Ca~(2+) signaling pathway[J];World Journal of Biological Chemistry;2014年01期

2 ;Abrupt changes in FKBP12.6 and SERCA2a expression contribute to sudden occurrence of ventricular fibrillation on reperfusion and are prevented by CPU86017[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年06期

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本文編號：2647398