本文關(guān)鍵詞：X-射線通過(guò)誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生促進(jìn)DC疫苗的抗腫瘤作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:腫瘤DC疫苗是腫瘤免疫治療中很有前景的方法之一,但隨著對(duì)腫瘤DC疫苗研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)由于受到腫瘤微環(huán)境的影響,單純使用腫瘤DC疫苗難以獲得滿意的結(jié)果。高能X-射線在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí),還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生HMGB-1及HSP70等內(nèi)源性因子,增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性。因此,X-射線照射可促進(jìn)腫瘤DC疫苗的抗瘤能力。但對(duì)X-射線與DC疫苗的聯(lián)合的方式以及二者聯(lián)合抗腫瘤的機(jī)制的研究還有待進(jìn)行深入研究。本研究以荷瘤小鼠為模型,首先觀察了X-射線照射后,腫瘤DC疫苗注射的時(shí)間窗對(duì)二者聯(lián)合抗腫瘤的影響,同時(shí)對(duì)聯(lián)合抗瘤的機(jī)制進(jìn)行了較系統(tǒng)的分析。方法:1 DC疫苗制備、活性及其抗原呈遞能力檢測(cè)處死BALB/c小鼠,取小鼠股骨的骨髓細(xì)胞,用含有GM-CSF(10ng/ml)和IL-4(10ng/ml)的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞分化,在培養(yǎng)的第5天,重新收集細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至1×106/ml,重新加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入X射線處理的4T1腫瘤細(xì)胞裂解液(終濃度50μg/ml),在37℃含飽和水氣、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育16小時(shí),然后再用LPS(100ng/ml)和IFN-Υ(10ng/ml)刺激36h進(jìn)一步誘導(dǎo)DCs的成熟,以此作為DC疫苗。用終濃度25μg/ml的絲裂霉素C處理的DC細(xì)胞做為刺激細(xì)胞,反應(yīng)細(xì)胞是雌性C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞。將反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞分別以200:1、100:1、50:1的比例加入到96孔U型板中孵育96小時(shí),孵育完成之前的4h每孔加入20μl Cell Titer 96#174;AQueous One Solution Reagent。用MTS比色法來(lái)檢測(cè)反應(yīng)細(xì)胞增殖情況。收集抗原負(fù)載的、LPS和IFN-Υ誘導(dǎo)成熟的DCs的培養(yǎng)上清,檢測(cè)IL-12p70的水平,以了解DC分泌IL-12的情況。同時(shí)收集抗原負(fù)載的、LPS和IFN-Υ誘導(dǎo)成熟的DCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11c、MHC II、CD86和ICAM-1的表達(dá)。2 X-射線對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)分析2.1 X-射線處理荷瘤小鼠將4T1細(xì)胞移植BALB/c小鼠右側(cè)第五對(duì)乳腺脂肪墊下,在腫瘤細(xì)胞移植的第七天將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組(8只/組)。未處理組、10Gy×3照射組(10Gy劑量照射,每日一次,連續(xù)3天)、30Gy照射組。2.2 Real-time PCR動(dòng)態(tài)分析腫瘤組織及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞IL-6、IL-10m RNA的表達(dá)在X-射線照射腫瘤塊后的第2、11和21天,分別處死荷瘤小鼠,分離腫瘤組織,分別提取腫瘤組織和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的總RNA,經(jīng)常規(guī)反轉(zhuǎn)錄后,用IL-6、IL-10特異性引物擴(kuò)增。2.3 ELISA分析TGF-β及TNF-α的水平在X-射線照射腫瘤塊后的第2、11和21天,分別處死荷瘤小鼠,分離腫瘤組織,PBS洗去血污,用含有蛋白酶抑制劑的500μl PBS進(jìn)行勻漿,12000r/min,4℃離心15min,取上清,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞因子測(cè)定。3觀察X射線聯(lián)合DC疫苗對(duì)荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)情況將4T1細(xì)胞經(jīng)腹部右側(cè)第五對(duì)乳腺脂肪墊移植給BALB/c小鼠,在腫瘤細(xì)胞移植的第七天將荷瘤小鼠隨機(jī)分為6組(7只/組)。未處理組、10Gy×3照射組(10Gy劑量照射,每日一次,連續(xù)3天)、30Gy照射組、10Gy×3+DC組(最后一次照射后48h,瘤周注射106個(gè)DC細(xì)胞,一周后再注射一次DC細(xì)胞)、30Gy+DC組(照射后48h,瘤周注射106個(gè)DC細(xì)胞,一周后再注射一次DC細(xì)胞)、DC組(瘤周注射106個(gè)DC細(xì)胞,一周后再注射一次)。接瘤后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑,按公式(長(zhǎng)徑×短徑2)/2計(jì)算腫瘤塊的體積(mm3),并觀察荷瘤小鼠存活時(shí)間,繪制生存曲線。4體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)同上述方法制備4T1荷瘤小鼠,在照射后的第3天,經(jīng)尾靜脈給荷瘤小鼠注射抗TNF-的抗體(20μg/鼠/100μl)或PBS,然后再在瘤內(nèi)注射106個(gè)DC疫苗,一周后再注射一次。觀察荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況。 5 X-射線照射聯(lián)合DC疫苗誘導(dǎo)長(zhǎng)效和系統(tǒng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答的觀察5.1給“治愈”的荷瘤小鼠第二次移植腫瘤采用劑量為30Gy的X-射線照射聯(lián)合DC疫苗治療后(即10Gy×3+DC和30Gy+DC實(shí)驗(yàn)組),部分荷瘤小鼠存活期超過(guò)15周。將存活期超過(guò)10周且荷瘤鼠的瘤塊小于300mm3的認(rèn)為是“治愈”的荷瘤小鼠。給此小鼠第二次在左側(cè)第二對(duì)乳腺脂肪墊下移植4T1細(xì)胞。對(duì)照組為第一次移植腫瘤的小鼠。5.2流式細(xì)胞儀分析荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、CD127和CD44的CD8+T數(shù)在第二次移植腫瘤的第28天,處死荷瘤小鼠,取荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,用腫瘤抗原體外刺激24h,流式細(xì)胞儀分析表達(dá)IFN-γ、CD127和CD44的CD8+T數(shù)。5.3流式細(xì)胞儀分析腫瘤組織中CD8+T和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-Reg)分布在第二次移植腫瘤的第28天,處死荷瘤小鼠,分離荷瘤小鼠的腫瘤組織并稱重。首先采用機(jī)械聯(lián)合酶解的方法得到腫瘤組織的但細(xì)胞懸液,再通過(guò)密度梯度離心的方法得到腫瘤組織浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析CD4+CD25+和CD8+的T細(xì)胞,并計(jì)算CD8+T/CD4+CD25+T的比率。5.4腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞CTL活性的測(cè)定在第二次移植腫瘤的第28天,處死荷瘤小鼠,分離腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞,再用含有50μg/ml的4T1腫瘤細(xì)胞裂解液和10ng/ml的IL-2的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天,以此作為效應(yīng)細(xì)胞。靶細(xì)胞為培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞和經(jīng)射線照射的4T1細(xì)胞。CTL活性測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn)的比色法和試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果:1 X射線處理的4T1細(xì)胞裂解液負(fù)載的DC表現(xiàn)高水平的抗原呈遞能力為了制備高活力的DC疫苗,本實(shí)驗(yàn)首先獲得了經(jīng)X-射線照射的4T1細(xì)胞的裂解液,用這種含有腫瘤抗原的裂解液負(fù)載DC并經(jīng)LPS和IFN-Υ誘導(dǎo)成熟,經(jīng)流式細(xì)胞儀分析可見(jiàn),MHC II、CD86及ICAM-1的表達(dá)與未經(jīng)X-射線照射的4T1裂解液負(fù)載的DCs沒(méi)有顯著差異;除了LPS刺激外,4T1裂解液并不能誘導(dǎo)DC產(chǎn)生IL-12。盡管如此,從 Fig.1c可見(jiàn),在DC與T細(xì)胞比率為50:1的情況下,用射線照射后的4T1裂解液負(fù)載的DC疫苗比未經(jīng)照射的4T1裂解液可明顯促進(jìn)DC的抗原呈遞能力(P0.01)。2 X-射線局部照射后提高腫瘤微環(huán)境的TNF-α水平為了解局部X-射線照射對(duì)腫瘤組織炎性因子表達(dá)的影響,為DC疫苗注射尋找合適的時(shí)間窗,首先利用real-time PCR動(dòng)態(tài)分析了腫瘤組織及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的IL-10和IL-6的m RNA表達(dá);同時(shí)利用ELISA檢測(cè)了腫瘤組織中TGF-β和TNF-α的水平。Fig.3可見(jiàn),在X-射線照射后的第2、11和21天,IL-10和IL-6的m RNA及TGF-β的水平均未發(fā)生明顯變化,而TNF-α的水平在照射后前2周,即第2和11天時(shí)明顯較未照射組顯著提高(P0.05),在照射后第21天明顯又降低。3 X-射線照射可促進(jìn)DC疫苗的抗腫瘤活性在4T1移植后的第7天,給予X-射線照射,然后在照射后的第3和第18天注射2次DC疫苗。從Fig.2可見(jiàn),未經(jīng)處理或僅注射DC疫苗的荷瘤小鼠,在腫瘤移植的第7周全部死亡,單獨(dú)給予X-射線的荷瘤小鼠,在12周前也全部死亡。在荷瘤的第15周,X-射線照射聯(lián)合DC疫苗組的荷瘤小鼠依然有20%-50%的存活,且腫瘤塊體積均小于300mm3。4 TNF-α中和抗體可解除射線聯(lián)合DC疫苗對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制進(jìn)一步分析TNF-α在射線照射促進(jìn)DC疫苗抗瘤作用的機(jī)制,在荷瘤小鼠接受射線照射的第2天,經(jīng)尾靜脈注射抗TNF-α的中和抗體,結(jié)果觀察到中和抗體不僅下調(diào)了腫瘤組織中的TNF-α水平,也明顯解除了射線聯(lián)合DC疫苗對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制(Fig.4)。5 X-射線聯(lián)合DC疫苗在荷瘤小鼠建立長(zhǎng)效和系統(tǒng)的抗腫瘤免疫5.1 X-射線聯(lián)合DC疫苗“治愈”的荷瘤小鼠抑制第二次移植瘤的生長(zhǎng)4T1荷瘤小鼠經(jīng)過(guò)X-射線聯(lián)合DC疫苗治療后,雖然有部分荷瘤小鼠死亡,但依然有20%-50%的荷瘤小鼠存活期超過(guò)15周(Fig.2)。由于X-射線照射后可明顯促進(jìn)TNF-α的水平,這很可能對(duì)DC疫苗誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答具有促進(jìn)作用。因此,為了驗(yàn)證這一假設(shè),給存活的荷瘤小鼠在遠(yuǎn)離“原發(fā)瘤”的左側(cè)第二對(duì)乳腺脂肪墊移植1×105個(gè)4T1細(xì)胞,對(duì)照組為第一次移植腫瘤的小鼠。由Fig.5可見(jiàn),100%的對(duì)照組小 鼠在腫瘤移植7天后全部見(jiàn)到明顯的瘤塊,且在荷瘤的第6周全部死亡。而經(jīng)過(guò)聯(lián)合治療的荷瘤小鼠在重新移植腫瘤后,有60%的小鼠在第二次移植腫瘤后的第10周才觀察到新的腫瘤塊。5.2 X-射線聯(lián)合DC疫苗“治愈”的荷瘤小鼠對(duì)腫瘤抗原產(chǎn)生了免疫記憶為了進(jìn)一步分析荷瘤小鼠的免疫功能,在第二次荷瘤的第4周,處死部分小鼠(每組3只),分析了脾臟淋巴細(xì)胞可分泌IFN-γ的CD8+T及表達(dá)CD127的記憶性CD8+T細(xì)胞數(shù),結(jié)果聯(lián)合治療組表達(dá)CD127的記憶細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組,且產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù)也多余對(duì)照組(Fig.5C)。5.3 X-射線聯(lián)合DC疫苗可提高腫瘤微環(huán)境中CD8+T/T-reg比例和腫瘤特異性CTL活性X-射線聯(lián)合DC疫苗在荷瘤小鼠可建立長(zhǎng)效和系統(tǒng)的抗腫瘤免疫,可能與腫瘤微環(huán)境中效應(yīng)T細(xì)胞的募集和CTL殺傷活性提高有關(guān)。因此,在聯(lián)合治療后的第19天,即最后一次DC疫苗注射后的第10天,分析了腫瘤組織中CD8+T及T-reg細(xì)胞數(shù),同時(shí)檢測(cè)了腫瘤組織浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞的CTL活性。Fig.6可見(jiàn),聯(lián)合治療組的腫瘤組織中CD8+T或CD8+T/T-reg比例均比對(duì)照組明顯增加;CTL活性也高于對(duì)照組。結(jié)論:1 X-射線照射后的前2周,腫瘤組織TNF-α水平升高,適合DC疫苗的注射;2 X-射線聯(lián)合DC疫苗可誘導(dǎo)長(zhǎng)效的抗腫瘤作用;3用抗TNF-α的中和抗體可解除X-射線聯(lián)合DC疫苗的抗腫瘤作用。
【關(guān)鍵詞】：X-射線 腫瘤DC疫苗 小鼠荷瘤模型 TNF-α TNF-α中和抗體 腫瘤微環(huán)境
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-17
• 英文縮寫17-18
• 前言18-19
• 材料與方法19-28
• 結(jié)果28-31
• 附圖31-38
• 討論38-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 綜述 放療促進(jìn)以樹(shù)突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療的研究進(jìn)展43-51
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 致謝51-52
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷52

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2 張峻嶺;陳子逸;陳國(guó)衛(wèi);劉玉村;;新的臨床前研究小鼠模型:腫瘤患者來(lái)源的移植瘤[J];腫瘤;2014年03期

3 王瑞幸;黃循銣;吳枝娟;林菁;方秋娟;;異十三基二乙胺體內(nèi)外抗腫瘤作用研究[J];中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2006年11期

4 齊茂松;鄭杰;;裸鼠體內(nèi)人類腫瘤常位異種移植[J];北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);1989年03期

5 沈秀;周則衛(wèi);王映蘭;王文;閻玉均;洪閣;;KM-HL近交系小鼠對(duì)腫瘤細(xì)胞敏感性的研究[J];中華腫瘤防治雜志;2008年05期

6 媄od生,V錘，

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