發(fā)布時間：2020-04-24 01:15

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)為單股正鏈RNA病毒,是引起人類急、慢性肝炎的重要病原體。HCV感染極易慢性化,其慢性率高達(dá)80%。HCV慢性感染是肝硬化、肝癌等嚴(yán)重終末期肝病的重要原因。長效干擾素聯(lián)合利巴韋林曾經(jīng)是治療HCV感染的標(biāo)準(zhǔn)方案,其療效受基因型的影響,且總體不甚理想。近年來上市的新一代直接抗病毒藥物(direct antiviral agents,DAAs)(如Ledipasvir和Sofosbuvir)使丙肝治療現(xiàn)狀發(fā)生重大改變,但這些藥物費(fèi)用昂貴,無法在短期內(nèi)普及使用,副作用以及耐藥突變等也有待更長時間的觀察。HCV基因組高度變異,這是HCV逃避宿主適應(yīng)性免疫而高發(fā)慢性感染的重要原因。除了變異以外,HCV還進(jìn)化有其他復(fù)雜的免疫逃避機(jī)制,尤其是逃避固有免疫應(yīng)答的機(jī)制,促使HCV慢性感染的發(fā)生。HCV分子克隆以后的近三十年,丙肝疫苗研究一直受到發(fā)達(dá)國家的重視,有多種類型的疫苗進(jìn)入或已經(jīng)完成了Ⅰ、Ⅱ期臨床期試驗,但目前沒有一種進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗階段。HCV的高變異使得疫苗研制舉步維艱,另一方面,HCV感染是否足以誘導(dǎo)保護(hù)水平的免疫應(yīng)答也存在爭議。HCV感染的藥物治療雖然取得了巨大進(jìn)展,但對于HCV慢性感染和免疫逃避機(jī)制的認(rèn)識還有很多未知,有待進(jìn)一步深入發(fā)掘,闡明這些錯綜復(fù)雜的問題,不僅能為人類控制HCV感染,也能為人類認(rèn)識其他病毒持續(xù)感染的機(jī)制提供重要線索。事實上,HCV目前已經(jīng)被作為研究病毒慢性感染機(jī)制的重要模型,在抗HCV藥物研發(fā)取得巨大進(jìn)展以后,HCV感染與致病機(jī)制依然受到學(xué)者的廣泛關(guān)注,研究熱度依然不減。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)HCV感染顯著上調(diào)Huh7細(xì)胞中硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)的表達(dá),且HCV感染高度依賴于TXNIP的表達(dá)。本論文在此基礎(chǔ)上,對HCV感染誘導(dǎo)TXNIP表達(dá)以及TXNIP促進(jìn)HCV感染的機(jī)制進(jìn)行了探索。本研究中,我們開展了以下實驗、獲得了如下結(jié)果:1)進(jìn)一步觀察和證實了HCV感染上調(diào)Huh7細(xì)胞中TXNIP的表達(dá)以及TXNIP分子對HCV感染的重要作用;2)通過RNA干擾技術(shù)確認(rèn)抑制細(xì)胞自噬導(dǎo)致Huh7細(xì)胞中HCV感染的下調(diào),以及抑制TXNIP的表達(dá)明顯降低無血清饑餓對細(xì)胞自噬的誘導(dǎo);3)對HCV感染的Huh7細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志分子的檢測,未觀察到HCV感染對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo);4)HCV感染Huh7細(xì)胞能低水平激活I(lǐng)FN-β的轉(zhuǎn)錄,外源性IFN-β能劑量依賴性上調(diào)Huh7細(xì)胞中TXNIP的表達(dá);5)HCV全長RNA和HCV 3’-UTR轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞能誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生和上調(diào)TXNIP的表達(dá);6)Huh7.5.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIG-I表達(dá)質(zhì)粒以后,細(xì)胞內(nèi)TXNIP的表達(dá)水平升高,且HCV感染能進(jìn)一步上調(diào)TXNIP的表達(dá),而HCV感染對naive Huh7.5.1內(nèi)的TXNIP表達(dá)無上調(diào)作用;7)Redd1分子可能與TXNIP協(xié)同參與對HCV感染的調(diào)控;8)鈣離子拮抗劑維拉帕米能通過抑制TXNIP的表達(dá)而抑制HCV感染。本論文通過上述研究建立了一種HCV慢性感染新機(jī)制的作用模型:HCV感染刺激宿主產(chǎn)生低水平干擾素(無論細(xì)胞模型中這種作用的高低程度如何,人類和黑猩猩感染HCV在肝組織內(nèi)普遍檢測到干擾素表達(dá)的明顯上調(diào)),干擾素上調(diào)TXNIP的表達(dá),TXNIP則通過促發(fā)細(xì)胞自噬增強(qiáng)HCV的復(fù)制。干擾素刺激表達(dá)的TXNIP不同于其他干擾素刺激基因表達(dá)產(chǎn)物,其作用不是抑制病毒感染,而是相反�；谶@一發(fā)現(xiàn),我們證明了一種臨床用于治療高血壓的廉價藥物維拉帕米通過抑制TXNIP的表達(dá)而抑制HCV感染,其用于臨床治療丙型肝炎的前景值得進(jìn)一步探討。
【圖文】：

碩士學(xué)位論文及自噬標(biāo)志分子 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平，qRT-PCR 檢測 HCV 感水平。結(jié)果顯示，相較于未感染組，HCV 感染 48 h 和 72 h和 mRNA 表達(dá)水平均顯著上調(diào)（圖 1A、圖 1B），表明 HC表達(dá)，與我們前期基因芯片分析以及轉(zhuǎn)錄組深度測序結(jié)果一8 h 和 72 h 時細(xì)胞中 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高，，且 72 組（圖 1A），表明 HCV 感染誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。

硫氧還蛋白互作蛋白參與 HCV 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以及逃避宿主固有免疫抑制 TXNIP 表達(dá)后 HCV 感染的陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（圖 2A）。Western blot 結(jié)果顯示抑制 TXNIP 表達(dá)后 HCV core 蛋白以及自噬標(biāo)志蛋白 LC3-Ⅱ的表達(dá)較對照均明顯降低（圖 2B）。用 TXNIP 慢病毒感染 Huh7 細(xì)胞，隨后用 HCVcc 感染，免疫熒光結(jié)果顯示過表達(dá)TXNIP 的Huh7細(xì)胞被HCVcc感染以后，HCV陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（圖2C），Western blot 結(jié)果顯示 HCV core 蛋白和 LC3 蛋白表達(dá)水平上調(diào)（圖 2D）。結(jié)果表明 TXNIP 的表達(dá)對于 HCV 感染至關(guān)重要。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 唐紫薇;王世杰;王文博;趙平;戚中田;;宿主細(xì)胞硫氧還蛋白互作蛋白與丙型肝炎病毒感染的相互作用研究[J];中華傳染病雜志;2016年10期

本文編號：2638358