發(fā)布時(shí)間：2020-04-21 21:34

【摘要】：目的掌握自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)的提取以及培養(yǎng)方法,觀察干擾素γ(IFN-γ)增強(qiáng)成人自體ADSCs對(duì)外周血淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。方法本研究方法為收集健康人體的ADSCs,將ADSCs進(jìn)行培養(yǎng)至第3代,觀察細(xì)胞形態(tài),對(duì)細(xì)胞表面分化抗原進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定,同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成脂以及成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn),對(duì)ADSCs進(jìn)行鑒定。收集分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),與ADSCs建立共培養(yǎng)體系共培養(yǎng)5d,在共培養(yǎng)體系中加入植物血凝素(PHA)和白細(xì)胞介素(IL-)2來活化T細(xì)胞。本研究共分三組,一組為IFN-γ誘導(dǎo)ADSCs的IFN-γ刺激組,一組為沒有IFN-γ誘導(dǎo)的未刺激組,一組為IFN-γ誘導(dǎo)ADSCs后又加入1-甲基色氨酸(1-MT)的IDO阻斷組。對(duì)照組單純采用PHA和IL-2刺激T細(xì)胞。每組與PBMCs按一定的比例共培養(yǎng),采用MTT法檢測(cè)T細(xì)胞增殖吸光度值,進(jìn)而計(jì)算出T細(xì)胞增殖抑制率。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出活化T細(xì)胞CD4+CD25+Treg比例。檢測(cè)IFN-γ對(duì)IDO基因以及蛋白水平的變化。結(jié)果ADSCs傳3代后形態(tài)為典型的紡錘形,貼壁生長(zhǎng);分離的自體ADSCs高表達(dá)分化群(CD)73、CD90、CD105陽性率均95%,低表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45,流式細(xì)胞術(shù)鑒定表面標(biāo)志物符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn);ADSCs具有分化為成脂和成骨細(xì)胞的能力。ADSCs與淋巴細(xì)胞比例為1:50時(shí),增殖抑制率為(20.25±3.10)%,比例為1:10時(shí)增殖抑制率為(52.75±4.85)%,比例為1:5時(shí)增殖抑制率為(65.75±5.12)%,T細(xì)胞的增值抑制率和細(xì)胞比例呈劑量依賴關(guān)系,IFN-γ預(yù)刺激組ADSCs與淋巴細(xì)胞比例為1:50時(shí),增殖抑制率為(48.00±5.35)%,比例為1:10時(shí)增殖抑制率為(70.75±4.19)%,比例為1:5時(shí)增殖抑制率為(79.50±6.19)%,T細(xì)胞的增值抑制率和細(xì)胞比例呈劑量依賴關(guān)系,并高于未刺激組;IFN-γ預(yù)刺激組CD4~+CD25~+Treg比例為(22.05±2.43)%與未刺激組相比顯著升高;IFN-γ預(yù)刺激組ADSCs內(nèi)IDO mRNA表達(dá)水平顯著高于未刺激組;IFN-γ預(yù)刺激組ADSCs內(nèi)IDO蛋白表達(dá)水平顯著高于未刺激組;IDO阻斷組對(duì)活化T細(xì)胞增殖抑制率較IFN-γ預(yù)刺激組顯著降低(P0.01)。結(jié)論隨ADSCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)比例增大,ADSCs對(duì)活化T細(xì)胞增殖的抑制率顯著提高,呈劑量依賴關(guān)系。進(jìn)一步利用IFN-γ預(yù)處理ADSCs,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ刺激顯著增強(qiáng)ADSCs負(fù)性調(diào)節(jié)作用。利用IFN-γ預(yù)處理ADSCs后ADSCs誘導(dǎo)活化T細(xì)胞向CD4~+CD25~+Treg亞群轉(zhuǎn)化的能力增強(qiáng)。PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IDO mRNA表達(dá)受IFN-γ影響,IFN-γ能促進(jìn)IDO mRNA表達(dá)。在蛋白質(zhì)水平上,IFN-γ也能促進(jìn)IDO蛋白表達(dá)。使用1-MT后能很大程度上抑制ADSCs介導(dǎo)的免疫抑制�？偠灾�,IFN-γ促進(jìn)ADSCs對(duì)活化T細(xì)胞免疫抑制能力,IDO在ADSCs介導(dǎo)的免疫抑制中起重要免疫調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

圖 1.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞分層1.1.3.9 ADSCs 對(duì)自體 T 細(xì)胞增殖能力的影響噻唑藍(lán)（MTT）比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活狀態(tài)的方法，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)�；罴�(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以使噻唑藍(lán)還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。對(duì)于細(xì)胞增殖的檢測(cè)，當(dāng)細(xì)胞增殖率較高時(shí)，由于活細(xì)胞數(shù)量較多，會(huì)導(dǎo)致溶液顏色較深。二甲基亞砜能溶解沉積在細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在 490 nm 處的光密度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。（1）使用傳代三代的 ADSCs 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng) ADSCs 融合至 90%時(shí)細(xì)胞狀態(tài)最好，加入 0.5mL 的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，使細(xì)胞都盡量成為單個(gè)細(xì)胞，不要粘連，消化結(jié)束后加入 5mL 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞充分吹勻。（2）收集細(xì)胞至離心管中，300g 離心 5min，收集細(xì)胞沉淀，加入 1mL 完

SCs 的細(xì)胞形態(tài)ADSCs接種于培養(yǎng)瓶24 h后均可見貼壁細(xì)胞，呈圓形或多角形，48h后首次換液，細(xì)胞貼壁較牢固，4～5d后梭形細(xì)胞逐漸樣生長(zhǎng)，，形成逐漸呈長(zhǎng)梭形外觀，10 d左右時(shí)，細(xì)胞集落達(dá)到生長(zhǎng)，細(xì)胞間緊密排列有一定方向感。約16 d左右細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶狀鏡下可見主要呈長(zhǎng)梭形，增長(zhǎng)趨勢(shì)穩(wěn)定，并成幾何倍數(shù)關(guān)DSCs形態(tài)比較均為典型的紡錘形，（見圖1.2）；ADSCs爬片色后,可見細(xì)胞主要呈梭形，也有多角形等形態(tài)，胞核染成紫紫色（見圖1.3）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2635765