【摘要】：目的:白藜蘆醇、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞均有抗衰老作用,本文旨在將二者聯(lián)合運(yùn)用與單獨(dú)作用的抗衰老效果作比較并探究其中機(jī)理。方法:采用酶消化-組織塊培養(yǎng)法中分離培養(yǎng)人眼瞼皮下脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Human dipose mesenchymal stem cells,hADSCs)和人真皮成纖維細(xì)胞(Human Dermal Fibroblasts,HDFs),流式細(xì)胞術(shù)鑒定hADSCs干細(xì)胞表型并行成脂誘導(dǎo),免疫組化鑒定HDFs的Ⅰ、Ⅲ型膠原;建立HDFs自然衰老細(xì)胞模型,采用transwell共培養(yǎng)小室將白藜蘆醇(RSV)、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)和自然衰老人真皮成纖維細(xì)胞(HDFs)分組共培養(yǎng),分為四個(gè)組:(1)hADSCs單獨(dú)作用于衰老人真皮成纖維細(xì)胞組;(2)RSV單獨(dú)作用于衰老人真皮成纖維細(xì)胞組;(3)hADSCs+RSV協(xié)同作用組;(4)對(duì)照組。采用蛋白印記的方法檢測(cè)共培養(yǎng)后各組細(xì)胞的SIRT1和β-catenin蛋白表達(dá)情況。qRT-PCR法檢測(cè)各組成纖維細(xì)胞的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-1、β-半乳糖苷酶的表達(dá)。結(jié)果:從人眼瞼皮下脂肪處提取得來的細(xì)胞,培養(yǎng)后流式細(xì)胞術(shù)鑒定hADSCs干細(xì)胞表型:表達(dá)CD90、CD105,不表達(dá)CD34、CD45,檢測(cè)結(jié)果符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表達(dá)。該細(xì)胞再加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)兩周后可見成串脂滴形成。從眼瞼真皮提取來的細(xì)胞培養(yǎng)后免疫組化染色表達(dá)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原,鑒定結(jié)果符合成纖維細(xì)胞。在transwell小室環(huán)境下共培養(yǎng)后,蛋白印記的方法檢測(cè)共培養(yǎng)后各組細(xì)胞的SIRT1和β-catenin蛋白表達(dá)情況為hADSCs+RSV協(xié)同作用組高于二者單獨(dú)作用組,QRT-PCR法檢測(cè)共培養(yǎng)后各組成纖維細(xì)胞的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達(dá)趨勢(shì)為hADSCs+RSV協(xié)同作用組高于二者單獨(dú)作用組。MMP-1、β-半乳糖苷酶的表達(dá)趨勢(shì)為hADSCs+RSV協(xié)同作用組低于二者單獨(dú)作用組。結(jié)論:原代培養(yǎng)源于真皮成纖維細(xì)胞在自然衰老后,白藜蘆醇與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合運(yùn)用的抗衰老效果優(yōu)于單獨(dú)運(yùn)用,且與間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)相關(guān)。
【圖文】：

2ml 濃度為 25μmol/ml 的含白藜蘆醇的 10%FBS 的低糖每孔置入上層提籃，但上層提籃不接種細(xì)胞，僅每籃加蘆醇的 10%FBS 的低糖 DMEM 培養(yǎng)基。③hADSCs+RSV 組：取 6 個(gè)鋪有脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞新加入 1ml 含 25μmol/ml 白藜蘆醇的 10%FBS 的低糖 衰老成纖維細(xì)胞的 6 孔板，吸棄原培養(yǎng)液，重新加入含0%FBS 的低糖 DMEM 培養(yǎng)基，然后小心用鑷子將 6 個(gè)提好標(biāo)記，隨后放入 37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。④對(duì)照組：取一塊鋪有衰老成纖維細(xì)胞的 6 孔板，吸 2ml 含 10%FBS 的低糖 DMEM 培養(yǎng)基，，上層提籃不接 10%FBS 的低糖 DMEM 培養(yǎng)基。分組共培養(yǎng)(共培養(yǎng)模式圖見圖 1)三天后，在倒置顯微學(xué)變化并拍照記錄。

圖 2 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)(×100)Figure 2 culture of human adipose mesenchymal stem cells (×100)從人眼瞼取得的皮下脂肪組織，用酶消化-組織塊培養(yǎng)法得到的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)過，將第 3 代細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察，可見沉淀組織邊緣有大量貼壁生長(zhǎng)的的細(xì)胞，狀排列，x100。圖 A 的細(xì)胞在高倍鏡下觀察細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，x100。 A The subcutaneous adipose tissue obtained from human eyelid was primarily cultured bye digestion and tissue mass culture. After passage, the third passage cells were observed undered microscope. It can be seen that there are a large number of adherent cells on the edge of theitated tissue, arranged in a whirlpool shape, x100. B Fig.A cells are long fusiform under high power microscope, x100.所培養(yǎng)得到的第 3 代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作鑒定 CD34、CD45、CD90、CD105 的流式檢測(cè)盡管 MSC 暫無特異性標(biāo)志物，但是根據(jù)其特異性表達(dá) SH2、SH3、和 SH4 以
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R339.38

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2632022