【摘要】：在生物體內(nèi),維持基因組的穩(wěn)定性是細(xì)胞正常生存的必要條件。然而,有許多外源因素和內(nèi)源因素會(huì)造成DNA的斷裂,如細(xì)胞代謝產(chǎn)物、UV和電離輻射等。為維持基因組的穩(wěn)定性,機(jī)體進(jìn)化出了高度保守的應(yīng)答體系,稱之為DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response,DDR)。DNA損傷應(yīng)答過程包括DNA損傷位點(diǎn)的識(shí)別、招募DNA修復(fù)復(fù)合物到DNA損傷位點(diǎn)、修復(fù)受損的DNA、激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)以及誘發(fā)凋亡[1],DNA損傷應(yīng)答對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程都有廣泛的影響。為確保足夠的時(shí)間完成精確有效的DNA損傷修復(fù),細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激活并使細(xì)胞周期阻滯。同時(shí),細(xì)胞也將激活一些基因的轉(zhuǎn)錄,這些基因包括DNA損傷修復(fù)和調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因。最近研究表明,不僅蛋白編碼基因,非編碼的基因也在維護(hù)基因組穩(wěn)定性過程中起到重要作用[1-3]。其中長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non coding RNA,lnc RNA)是一類由RNA聚合酶Ⅱ產(chǎn)生,長(zhǎng)度大于200bp的RNA,它們的表達(dá)量低,保守性低,且具有組織特異性。當(dāng)DNA損傷后,DDR相關(guān)lnc RNA會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及RNA降解水平被調(diào)控。同樣的,lnc RNA也可以靶向DDR相關(guān)的基因調(diào)控其表達(dá)。lnc RNA可以作為信號(hào)、誘餌、導(dǎo)引、支架調(diào)控基因表達(dá)。近幾年來,雖然已經(jīng)在lnc RNA維護(hù)基因組穩(wěn)定性方面做過很多研究,識(shí)別了許多參與DNA損傷應(yīng)答的lnc RNA,但lnc RNA如何參與DNA損傷應(yīng)答以及它們的應(yīng)答機(jī)制仍然是未知的。在來自清華大學(xué)高冠軍教授實(shí)驗(yàn)室的大力支持下,我們獲得了43株lnc RNA敲除的果蠅株。為研究參與DNA損傷應(yīng)答的lnc RNA,我們采用在輻照后統(tǒng)計(jì)生存率和染色體斷裂數(shù)目的方法,對(duì)43株lnc RNA敲除果蠅株進(jìn)行了DNA損傷敏感性的檢測(cè),獲得了12株具有DNA損傷敏感性的lnc RNA敲除果蠅株,初步認(rèn)為這12個(gè)lnc RNA可能參與DNA損傷應(yīng)答。為系統(tǒng)性的篩選出更多參與DNA損傷應(yīng)答的lnc RNA,采用了高通量測(cè)序技術(shù),使用野生型w1118果蠅、p53突變果蠅、e2f1突變果蠅的三期幼蟲,在生理?xiàng)l件和輻照條件下,獲得了242個(gè)差異表達(dá)的lnc RNA。此外,在43株lnc RNA敲除果蠅株里面,CR43356在RNA測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)了差異表達(dá)。DNA損傷敏感性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明,CR43356敲除果蠅株對(duì)DNA損傷高度敏感。通過查找Fly Base網(wǎng)站信息,發(fā)現(xiàn)CR43356主要在果蠅三期幼蟲的翅膀胚芽組織中表達(dá)。為進(jìn)一步探究CR43356參與DNA損傷應(yīng)答的機(jī)制,我們對(duì)CR43356果蠅進(jìn)行了G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)檢測(cè)和凋亡檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CR43356參與DNA損傷應(yīng)答通路中凋亡調(diào)控過程。
【圖文】：

31圖 1 lncRNA 敲除果蠅 DNA 損傷敏感性檢測(cè)。A. lncRNA 敲除果蠅生存率曲線。lncRNA 敲除果蠅株在不同輻照劑量處理后，統(tǒng)計(jì)其羽化情況，繪圖分析。存活數(shù)量與w1118相比表現(xiàn)出顯著差異的lncRNA，認(rèn)為相應(yīng)lncRNA可能參與DNA損傷應(yīng)答，共 12 株 lncRNA 敲除果蠅株。B.存活數(shù)量與 w1118相比無顯著差異的 lncRNA，認(rèn)為相應(yīng) lncRNA 不參與 DNA 損傷應(yīng)答，共 29 株 lncRNA 敲除果蠅株。C. 染色體斷裂數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖。在 20Gy 輻照處理?xiàng)l件下統(tǒng)計(jì) lncRNA 敲除果蠅株三期幼蟲腦組織中染色體斷裂數(shù)目，使用 t 檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p＞0.05 認(rèn)為無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。 ：p≤0.05; ：p≤0.01; ：p≤0.0001;3.2 參與 DNA 損傷應(yīng)答相關(guān) lncRNA 的鑒定p53 和 E2f1 作為非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，它們可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞因子以

大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 RNA 來參與 DNA 損傷應(yīng)答，在 DNA 損失修復(fù)，，凋亡等生物學(xué)進(jìn)程中十分重要的作用[16, 17]。為進(jìn)一步篩選出更多參與 DNA 損傷應(yīng)答且被錄調(diào)控的的 lncRNA,本課題采用了高通量測(cè)序技術(shù)使用野生型果蠅果蠅 p535A-1-4，e2f1 突變果蠅株 e2f107172/i2的三期幼蟲在生理?xiàng)l件和照處理的條件下，分別提取總 RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后，進(jìn)行測(cè)序饋的 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)分析流程圖如圖 2 所示：
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2629275