【摘要】：背景從全球范圍內(nèi)來看,近年來,空氣污染逐年加重,尤其是霧霾污染,呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢~([1]),在中等收入國家,死亡率排名前三的疾病分別是:腦血管疾病(約占死亡人口數(shù)的14.4%),缺血性心臟病(約占12.7%),慢性阻塞性肺疾病(約占12.0%)~([2]),尤其是秋冬季節(jié),呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率更高,其中,人體暴露于可吸入肺顆粒物PM2.5的幾率大大增加是主要因素。目前,我國已成為全球空氣污染最嚴(yán)重的地區(qū),其中,北京、天津、河北、長江三角洲區(qū)域、成都、重慶和中原地區(qū)是全球范圍內(nèi)污染最嚴(yán)重的地區(qū),PM2.5等年平均空氣污染物超過每立方米70微克,超過國家標(biāo)準(zhǔn)的2倍以上,高于WHO指導(dǎo)值的7倍以上。從2009-2012年1月份同期衛(wèi)星遙感數(shù)據(jù)來看,1月份灰霾污染的頻次、影響范圍、影響強度均呈現(xiàn)增加態(tài)勢,特別是2013年1月份發(fā)生的灰霾事件波及了超過130萬平方公里的面積,人口有11億人受到灰霾的嚴(yán)重污染,這在全世界范圍內(nèi),持續(xù)時間長、覆蓋面廣、污染程度高都屬于罕見情況。這對呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展機制、病理生理學(xué)、藥物毒理學(xué)等方面的研究和應(yīng)用提出了新要求~([3])。而人原代支氣管上皮細胞是吸入的外源性毒物進入機體后首先分離和培養(yǎng)的研究對于構(gòu)建體外呼吸道模型起到非常重要的作用,進一步參與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展、炎癥機制、藥物反應(yīng)、空氣污染的治理、公共衛(wèi)生等方面的研究和應(yīng)用。目前已有報道的人原代支氣管上皮細胞的分離方法是蛋白酶消化法~([11])和組織貼塊法~([10]),使獲取的樣本組織分散為單個細胞,用于體外研究。本研究通過纖維支氣管鏡刷檢直接獲取單個支氣管上皮細胞而不需要經(jīng)過蛋白酶消化和組織貼塊法進一步分離,節(jié)省實驗步驟和時間,并且盡可能多的保留人原代支氣管上皮細胞的原有結(jié)構(gòu),為探索一種高效便捷的人支氣管上皮細胞體外培養(yǎng)模型建立基礎(chǔ)。目的分離、純化并優(yōu)化體外人支氣管上皮細胞原代培養(yǎng)方法并進行鑒定,旨在為研究呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病和藥物毒理學(xué)等方面的應(yīng)用提供良好的研究載體和實驗依據(jù)。方法(1)呼吸道組織采樣:在新鄉(xiāng)市某醫(yī)院支氣管鏡室內(nèi),經(jīng)被檢查者及家屬同意,由纖維支氣管鏡刷檢獲取相對正常的人支氣管強表層組織,進行初采樣,確保所獲樣本細胞較高的接種存活率;(2)原代人支氣管上皮細胞的純化、分離和培養(yǎng):采用無血清的BEGM培養(yǎng)基進行人支氣管上皮細胞的純化和分離,行原代培養(yǎng)并傳代,臺盼藍染色測定細胞存活率;(3)細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)鑒別:通過倒置相差顯微鏡和免疫熒光染色觀察細胞特性并鑒定。(4)細胞功能檢測:用人白介素8(IL-8/CXCL8)酶聯(lián)免疫試劑盒和乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒檢測細胞功能。結(jié)果(1)經(jīng)纖維支氣管鏡刷檢可建立一種簡單的分離人原代支氣管上皮細胞的方法,能夠獲取較多單個的支氣管上皮細胞,不借助消化酶的作用;(2)經(jīng)纖維支氣管鏡刷檢獲取和分離的人原代支氣管上皮細胞體外培養(yǎng)存活率可達96.8%;(3用此方法獲取的細胞樣本,我們用無血清培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng),并收集,用上皮細胞特有標(biāo)記物角蛋白8單克隆抗體行免疫熒光染色鑒定,證實所培養(yǎng)的原代細胞是人支氣管上皮細胞。(4)用不同濃度的可吸入肺顆粒物PM2.5刺激經(jīng)此種方法獲取并在體外進行培養(yǎng)的人原代支氣管上皮細胞,并分別檢測刺激以后細胞中白介素8和乳酸脫氫酶的水平,證實經(jīng)纖維支氣管鏡刷檢獲取并培養(yǎng)的人原代支氣管上皮細胞功能正常。結(jié)論(1)經(jīng)纖維支氣管鏡刷檢獲取和分離人支氣管上皮細胞,是一種簡單易操作、快捷有效的方法;(2)經(jīng)纖維支氣管鏡刷檢獲取的人原代支氣管上皮細胞體外培養(yǎng)存活率高,可達96.8%;(3)經(jīng)纖維支氣管鏡刷檢獲取的人原代細胞經(jīng)免疫熒光染色鑒定被證實為人原代支氣管上皮細胞;(4)經(jīng)纖維支氣管鏡刷檢獲取的人原代支氣管上皮細胞對大氣可吸入肺顆粒物PM2.5刺激敏感,細胞功能正常。
【圖文】：

密0%—80將細胞后，收存細胞新鄉(xiāng)醫(yī)密集呈鋪路0%，見圖 1胞經(jīng)胰蛋白酶收集細胞，離胞。醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)路石樣分布生10；原代培酶-EDTA 消離心（1500學(xué)位論文 生長，，細胞培養(yǎng)第 20 天消化液（0.20 轉(zhuǎn)/分，離胞大小均勻天，細胞生5%）進行離心 5 分鐘

密0%—80將細胞后，收存細胞鏡刷檢透明，密集呈鋪路0%，見圖 1胞經(jīng)胰蛋白酶收集細胞，離胞。檢獲得的人呈單個、散路石樣分布生10；原代培酶-EDTA 消離心（1500人支氣管上皮散在分布（生長，細胞培養(yǎng)第 20 天消化液（0.20 轉(zhuǎn)/分，離皮細胞，原代（x100）胞大小均勻天，細胞生5%）進行離心 5 分鐘代培養(yǎng)第
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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1 Qian Liu;Cheng Xu;Guixiang Ji;Hui Liu;Wentao Shao;Chunlan Zhang;Aihua Gu;Peng Zhao;;Effect of exposure to ambient PM_(2.5) pollution on the risk of respiratory tract diseases:a meta-analysis of cohort studies[J];The Journal of Biomedical Research;2017年02期

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本文編號：2628872