【摘要】：麻疹(Measles)是由麻疹病毒(Measles virus,MV)引起的嚴(yán)重威脅公眾健康的急性傳染病,其傳染性強(qiáng),在人口密集而未接種疫苗的地區(qū)易于流行。麻疹尚無特異治療藥物,預(yù)防麻疹感染關(guān)鍵在于接種麻疹疫苗。麻疹疫苗在我國廣泛使用后,大大降低麻疹在人群中的發(fā)病率,中國麻疹疫情得到了很好的控制。但2005年以后我國麻疹疫情出現(xiàn)大幅度回升。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),麻疹重新流行的主要原因主要為以下三點(diǎn):一是偏遠(yuǎn)地區(qū)兒童疫苗接種率低;二是現(xiàn)有疫苗免疫持久性達(dá)不到終身免疫,大齡兒童體內(nèi)麻疹抗體水平衰減;三是與疫苗株相比,麻疹病毒流行株在基因組已經(jīng)發(fā)生了不少突變,特別是與麻疹病毒抗體產(chǎn)生有關(guān)的N、H兩個(gè)基因差異明顯,可能對(duì)疫苗株免疫效果產(chǎn)生了一定的影響。且現(xiàn)有“滬191”麻疹病毒疫苗株仍會(huì)引起一些溫和的一定副反應(yīng),所以研發(fā)免疫持久力更好、安全性更優(yōu)的新型麻疹疫苗越發(fā)顯得迫切。運(yùn)用反向遺傳學(xué)技術(shù),建立麻疹病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)對(duì)麻疹病毒基因組進(jìn)行相應(yīng)的突變、缺失或插入,從而獲得安全性更高,免疫能力更好的新型麻疹病毒疫苗株,是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn),也是開發(fā)新型麻疹減毒疫苗的最佳研究手段。麻疹病毒屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae),麻疹病毒屬(Morbillivirus),為單股負(fù)鏈RNA病毒。運(yùn)用反向遺傳學(xué)技術(shù),將病毒全長基因組克隆和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于哺乳動(dòng)物細(xì)胞可在體外重新拯救出麻疹病毒。本研究構(gòu)建了“滬191”麻疹病毒疫苗株的全長基因組cDNA克隆,構(gòu)建了能夠表達(dá)麻疹病毒N、P、L蛋白的3個(gè)輔助質(zhì)粒,全長質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于BHK-SR19-T7細(xì)胞后,成功拯救出“滬191”麻疹病毒疫苗株(rMV-Hu191),代表“滬191”麻疹病毒疫苗株的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)構(gòu)建成功。與宿主細(xì)胞相似,病毒mRNA加工對(duì)病毒基因組的復(fù)制和病毒蛋白表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。單股負(fù)鏈RNA病毒的mRNA后期需要通過加帽、甲基化、聚腺苷酸化等一系列修飾,其中病毒mRNA的加帽、甲基化對(duì)病毒mRNA的穩(wěn)定、翻譯最為重要。與宿主細(xì)胞不同的是病毒mRNA的加帽、甲基化過程中所需的一系列酶催化反應(yīng)均由病毒的L蛋白完成,破壞病毒L蛋白mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的功能能夠抑制病毒mRNA帽子結(jié)構(gòu)的甲基化,使病毒毒力減弱。病毒L蛋白mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶擁有一個(gè)催化活性位點(diǎn)和與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)結(jié)合位點(diǎn),在帽結(jié)構(gòu)甲基化過程中S-腺苷甲硫氨酸為L蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶甲基供體。本研究我們對(duì)“滬191”麻疹病毒疫苗株L蛋白mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合位點(diǎn)保守區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建了 3個(gè)mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷的“滬191”麻疹病毒疫苗株全長基因組質(zhì)粒突變體pMV-Hu191-G1788A,pMV-Hu191-G1790A,pMV-Hu191-G1792A,基于成功構(gòu)建的麻疹病毒“滬191”疫苗株的反向遺傳學(xué)系統(tǒng),拯救出2株mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷麻疹病毒疫苗株rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A。在體外實(shí)驗(yàn)中:rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A形成的噬斑明顯小于 rMV-Hu191,rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A 在 Vero 細(xì)胞上出現(xiàn)CPE的時(shí)間,病毒達(dá)到最高滴度的時(shí)間要晚于rMV-Hu191。rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A表現(xiàn)為致弱或中度致弱,在細(xì)胞上連續(xù)傳代時(shí),rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A能夠保持良好的穩(wěn)定性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:一、棉鼠肺內(nèi)rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1792A滴度低于 rMV-Hu191;rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1792A 對(duì)棉鼠肺組織造成的損傷弱于 rMV-Hu191。二、rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1788A 在棉鼠體內(nèi)遺傳穩(wěn)定性良好。三、rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1788A能夠保護(hù)棉鼠不受高滴度麻疹病毒攻毒感染。四、rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A兩株mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷麻疹病毒疫苗株免疫持久性要優(yōu)于rMV-Hu191。研究結(jié)果表明通過抑制病毒L蛋白mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性來獲得麻疹病毒減毒的策略可行,同時(shí)rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1788A可作為兩株理想的疫苗候選株�！皽�191”麻疹病毒疫苗株的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的成功建立,為今后研究麻疹病毒致病機(jī)制,基因結(jié)構(gòu)、遺傳變異等方面奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ);也為研發(fā)新型麻疹疫苗、麻疹載體疫苗提供了提供了強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)。mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷麻疹病毒疫苗株的研發(fā)成功則為今后研發(fā)新型麻疹疫苗開發(fā)提供了新方向,副粘病毒mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶所在的區(qū)域非常保守,破壞麻疹病毒mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶致弱麻疹病毒的策略也可用于其他副粘病毒疫苗的研制開發(fā)。
【圖文】：

圖１－２：邋ｐｌ０７１０９－ＭＶ（＋）構(gòu)建示意圖逡逑１．２．４．１具體步驟如下：逡逑以邋１．２．２邋中邋ｐＢＩｕｎｔ－Ｎ邋為模板，用引物邋Ｔ７－－ＭＶ－Ｎ－Ｆ１、Ｎ１０７－Ｌ１０９－Ｒ邋擴(kuò)增邋３ＮＣＴ，逡逑以１．２．２中ｐＢｌｕｎｔ－Ｌ２為模板，，用引物ＭＶ－Ｌ１０９－Ｆ、ＭＶ－Ｌ－Ｒ擴(kuò)增５ＮＣＴ；以本實(shí)逡逑驗(yàn)保存ｐＪＡＺＺ質(zhì)粒為模板，Ｌ－ＨＤＶ－Ｆ、ＨＤＶ－Ｔ７－ｔｅｒ－Ｒｌ為模板擴(kuò)增ＨＤＶ－Ｔｅｒ－１。逡逑ＰＣＲ產(chǎn)物跑ＤＮＡ凝膠電泳，回收目的片段。目的片段回收與純化的具體步驟同逡逑１．２．２．３。逡逑以邋３ＮＣＴ、５ＮＣＴ邋為模板，Ｔ７－－ＭＶ－Ｎ－Ｆ１、ＭＶ－Ｌ－Ｒ邋為引物擴(kuò)增逡逑Ｔ７－３ＮＣＴ－５ＮＣＴ，以邋ＨＤＶ－Ｔｅｒ－１邋為模板，以邋Ｌ－ＨＤＶ－Ｆ、ＨＤＶ－Ｔ７－ｔｅｒ－Ｒ２邋為引物擴(kuò)逡逑增目的片段ＨＤＶ－Ｔｅｒ－２．ＰＣＲ產(chǎn)物跑ＤＮＡ凝膠電泳，回收目的片段。目的片段回逡逑收與純化的具體步驟同１．２．２．３。逡逑

使用邋ＧｅｎｅＡｒｔ？邋Ｈｉｇｈ－Ｏｒｄｅｒ邋Ｇｅｎｅｔｉｃ邋Ａｓｓｅｍｂｌｙ邋Ｓｙｓｔｅｍ邋試劑盒將涵蓋滬“１９１”麻逡逑疹病毒疫苗株全基因組序列的Ｎ、Ｐ、Ｍ１、Ｍ２、Ｆ、Ｈ、Ｌｌ、Ｌ２等８個(gè)片段一次逡逑性連到ｐＹＥＳ－２改造在載體中。構(gòu)建示意圖如圖１－３所示。具體步驟如下：逡逑１邐！佭邐＇ｉ邋概：邐Ｉ邋歘邐Ｕｍｉ邐Ｉｔｉｓｓｅ逡逑ｐＥＡＳＹ－Ｎ邋ＰＥＡＳＹ．Ｐ邋Ｐ￡ＡＳＹ＇Ｍ２邋ｐＥＡＳＹ－Ｆ」璧艦邋ｐＥＡＳＹ＾．１邐ｐ￡ＡＳＹ＾＾？逡逑ｍｓｍｅｍｍｓｍｅ邐ｍｍｔｍｓｍｉｗｉＸ邐ａｍｍｍｍｉｍｔｓｍｘｓｍｉｍｓｍ逡逑ｐＥＡ￥Ｙ＾１邐Ａ逡逑＇邐．．．．．邐■■邐－邐？邐—邐￣Ｔ７邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ逡逑３ＮＣＴ邋ｔ邋５ＮＣＴ邋１邋ｈ邋Ｈ＾ｋ邐１７逡逑，�。愤姡埽ミ姡殄澹慑澹剑颍觯铮睿悖铮洌椋睿珏澹簦澹恚簦椋睿幔眨澹纾椋铮睿箦义希苓姡蔬姡坼澹担危茫藻�；邋＝ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ邋ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｒｅｇｒｏｎｓ逡逑ｐ
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 Sun Hyoung Park;Dong Hun Lee;Jang Yong Jin;Young-Lim Shin;Meeyong Shin;Sung Shin Kim;Won Suk Suh;Jae Ock Park;Yong Hee Hong;;Measles outbreaks in the Kyeongin area of the Republic of Korea, 2013-2014: A single-center experience in a country of measles elimination[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2017年01期

2 唐金芳;石健;;現(xiàn)階段我國麻疹流行特點(diǎn)及應(yīng)對(duì)策略[J];疾病監(jiān)測(cè)與控制;2014年05期

3 徐聞青;陳志慧;;“滬191”麻疹減毒活疫苗為中國消除麻疹作出貢獻(xiàn)[J];上海醫(yī)藥;2010年02期

4 馮燕;盧亦愚;嚴(yán)菊英;姜曉慧;史雯;徐昌平;李榛;;不同人群血清對(duì)麻疹疫苗株與流行株的中和能力比較[J];中華流行病學(xué)雜志;2007年11期

本文編號(hào)：2622104