天堂国产午夜亚洲专区-少妇人妻综合久久蜜臀-国产成人户外露出视频在线-国产91传媒一区二区三区

“滬191”麻疹病毒疫苗株反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立及mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷麻疹病毒疫苗株研發(fā)

發(fā)布時(shí)間:2020-04-10 10:16
【摘要】:麻疹(Measles)是由麻疹病毒(Measles virus,MV)引起的嚴(yán)重威脅公眾健康的急性傳染病,其傳染性強(qiáng),在人口密集而未接種疫苗的地區(qū)易于流行。麻疹尚無特異治療藥物,預(yù)防麻疹感染關(guān)鍵在于接種麻疹疫苗。麻疹疫苗在我國廣泛使用后,大大降低麻疹在人群中的發(fā)病率,中國麻疹疫情得到了很好的控制。但2005年以后我國麻疹疫情出現(xiàn)大幅度回升。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),麻疹重新流行的主要原因主要為以下三點(diǎn):一是偏遠(yuǎn)地區(qū)兒童疫苗接種率低;二是現(xiàn)有疫苗免疫持久性達(dá)不到終身免疫,大齡兒童體內(nèi)麻疹抗體水平衰減;三是與疫苗株相比,麻疹病毒流行株在基因組已經(jīng)發(fā)生了不少突變,特別是與麻疹病毒抗體產(chǎn)生有關(guān)的N、H兩個(gè)基因差異明顯,可能對(duì)疫苗株免疫效果產(chǎn)生了一定的影響。且現(xiàn)有“滬191”麻疹病毒疫苗株仍會(huì)引起一些溫和的一定副反應(yīng),所以研發(fā)免疫持久力更好、安全性更優(yōu)的新型麻疹疫苗越發(fā)顯得迫切。運(yùn)用反向遺傳學(xué)技術(shù),建立麻疹病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)對(duì)麻疹病毒基因組進(jìn)行相應(yīng)的突變、缺失或插入,從而獲得安全性更高,免疫能力更好的新型麻疹病毒疫苗株,是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn),也是開發(fā)新型麻疹減毒疫苗的最佳研究手段。麻疹病毒屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae),麻疹病毒屬(Morbillivirus),為單股負(fù)鏈RNA病毒。運(yùn)用反向遺傳學(xué)技術(shù),將病毒全長基因組克隆和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于哺乳動(dòng)物細(xì)胞可在體外重新拯救出麻疹病毒。本研究構(gòu)建了“滬191”麻疹病毒疫苗株的全長基因組cDNA克隆,構(gòu)建了能夠表達(dá)麻疹病毒N、P、L蛋白的3個(gè)輔助質(zhì)粒,全長質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于BHK-SR19-T7細(xì)胞后,成功拯救出“滬191”麻疹病毒疫苗株(rMV-Hu191),代表“滬191”麻疹病毒疫苗株的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)構(gòu)建成功。與宿主細(xì)胞相似,病毒mRNA加工對(duì)病毒基因組的復(fù)制和病毒蛋白表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。單股負(fù)鏈RNA病毒的mRNA后期需要通過加帽、甲基化、聚腺苷酸化等一系列修飾,其中病毒mRNA的加帽、甲基化對(duì)病毒mRNA的穩(wěn)定、翻譯最為重要。與宿主細(xì)胞不同的是病毒mRNA的加帽、甲基化過程中所需的一系列酶催化反應(yīng)均由病毒的L蛋白完成,破壞病毒L蛋白mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的功能能夠抑制病毒mRNA帽子結(jié)構(gòu)的甲基化,使病毒毒力減弱。病毒L蛋白mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶擁有一個(gè)催化活性位點(diǎn)和與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)結(jié)合位點(diǎn),在帽結(jié)構(gòu)甲基化過程中S-腺苷甲硫氨酸為L蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶甲基供體。本研究我們對(duì)“滬191”麻疹病毒疫苗株L蛋白mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合位點(diǎn)保守區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建了 3個(gè)mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷的“滬191”麻疹病毒疫苗株全長基因組質(zhì)粒突變體pMV-Hu191-G1788A,pMV-Hu191-G1790A,pMV-Hu191-G1792A,基于成功構(gòu)建的麻疹病毒“滬191”疫苗株的反向遺傳學(xué)系統(tǒng),拯救出2株mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷麻疹病毒疫苗株rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A。在體外實(shí)驗(yàn)中:rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A形成的噬斑明顯小于 rMV-Hu191,rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A 在 Vero 細(xì)胞上出現(xiàn)CPE的時(shí)間,病毒達(dá)到最高滴度的時(shí)間要晚于rMV-Hu191。rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A表現(xiàn)為致弱或中度致弱,在細(xì)胞上連續(xù)傳代時(shí),rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A能夠保持良好的穩(wěn)定性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:一、棉鼠肺內(nèi)rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1792A滴度低于 rMV-Hu191;rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1792A 對(duì)棉鼠肺組織造成的損傷弱于 rMV-Hu191。二、rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1788A 在棉鼠體內(nèi)遺傳穩(wěn)定性良好。三、rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1788A能夠保護(hù)棉鼠不受高滴度麻疹病毒攻毒感染。四、rMV-Hu191-G1788A,rMV-Hu191-G1792A兩株mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷麻疹病毒疫苗株免疫持久性要優(yōu)于rMV-Hu191。研究結(jié)果表明通過抑制病毒L蛋白mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性來獲得麻疹病毒減毒的策略可行,同時(shí)rMV-Hu191-G1788A、rMV-Hu191-G1788A可作為兩株理想的疫苗候選株!皽191”麻疹病毒疫苗株的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的成功建立,為今后研究麻疹病毒致病機(jī)制,基因結(jié)構(gòu)、遺傳變異等方面奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ);也為研發(fā)新型麻疹疫苗、麻疹載體疫苗提供了提供了強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)。mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷麻疹病毒疫苗株的研發(fā)成功則為今后研發(fā)新型麻疹疫苗開發(fā)提供了新方向,副粘病毒mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶所在的區(qū)域非常保守,破壞麻疹病毒mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶致弱麻疹病毒的策略也可用于其他副粘病毒疫苗的研制開發(fā)。
【圖文】:

示意圖,示意圖,模板,片段


圖1-2:邋pl07109-MV(+)構(gòu)建示意圖逡逑1.2.4.1具體步驟如下:逡逑以邋1.2.2邋中邋pBIunt-N邋為模板,用引物邋T7--MV-N-F1、N107-L109-R邋擴(kuò)增邋3NCT,逡逑以1.2.2中pBlunt-L2為模板,,用引物MV-L109-F、MV-L-R擴(kuò)增5NCT;以本實(shí)逡逑驗(yàn)保存pJAZZ質(zhì)粒為模板,L-HDV-F、HDV-T7-ter-Rl為模板擴(kuò)增HDV-Ter-1。逡逑PCR產(chǎn)物跑DNA凝膠電泳,回收目的片段。目的片段回收與純化的具體步驟同逡逑1.2.2.3。逡逑以邋3NCT、5NCT邋為模板,T7--MV-N-F1、MV-L-R邋為引物擴(kuò)增逡逑T7-3NCT-5NCT,以邋HDV-Ter-1邋為模板,以邋L-HDV-F、HDV-T7-ter-R2邋為引物擴(kuò)逡逑增目的片段HDV-Ter-2.PCR產(chǎn)物跑DNA凝膠電泳,回收目的片段。目的片段回逡逑收與純化的具體步驟同1.2.2.3。逡逑

示意圖,麻疹病毒,構(gòu)建策略,疹病


使用邋GeneArt?邋High-Order邋Genetic邋Assembly邋System邋試劑盒將涵蓋滬“191”麻逡逑疹病毒疫苗株全基因組序列的N、P、M1、M2、F、H、Ll、L2等8個(gè)片段一次逡逑性連到pYES-2改造在載體中。構(gòu)建示意圖如圖1-3所示。具體步驟如下:逡逑1邐!佭邐'i邋概:邐I邋歘邐Umi邐Itisse逡逑pEASY-N邋PEASY.P邋P£ASY'M2邋pEASY-F」璧艦邋pEASY^.1邐p£ASY^^?逡逑msmemmsme邐mmtmsmiwiX邐ammmmimtsmxsmimsm逡逑pEA¥Y^1邐A逡逑'邐.....邐■■邐-邐?邐—邐 ̄T7邋promoter逡逑3NCT邋t邋5NCT邋1邋h邋H^k邐17逡逑,。愤姡埽ミ姡殄澹慑澹剑颍觯铮睿悖铮洌椋睿珏澹簦澹恚簦椋睿幔眨澹纾椋铮睿箦义希苓姡蔬姡坼澹担危茫藻;邋=noncoding邋terminal邋regrons逡逑p
【學(xué)位授予單位】:浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2018
【分類號(hào)】:R392

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 Sun Hyoung Park;Dong Hun Lee;Jang Yong Jin;Young-Lim Shin;Meeyong Shin;Sung Shin Kim;Won Suk Suh;Jae Ock Park;Yong Hee Hong;;Measles outbreaks in the Kyeongin area of the Republic of Korea, 2013-2014: A single-center experience in a country of measles elimination[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2017年01期

2 唐金芳;石健;;現(xiàn)階段我國麻疹流行特點(diǎn)及應(yīng)對(duì)策略[J];疾病監(jiān)測(cè)與控制;2014年05期

3 徐聞青;陳志慧;;“滬191”麻疹減毒活疫苗為中國消除麻疹作出貢獻(xiàn)[J];上海醫(yī)藥;2010年02期

4 馮燕;盧亦愚;嚴(yán)菊英;姜曉慧;史雯;徐昌平;李榛;;不同人群血清對(duì)麻疹疫苗株與流行株的中和能力比較[J];中華流行病學(xué)雜志;2007年11期



本文編號(hào):2622104

資料下載
論文發(fā)表

本文鏈接:http://sikaile.net/xiyixuelunwen/2622104.html


Copyright(c)文論論文網(wǎng)All Rights Reserved | 網(wǎng)站地圖 |

版權(quán)申明:資料由用戶39b0b***提供,本站僅收錄摘要或目錄,作者需要?jiǎng)h除請(qǐng)E-mail郵箱bigeng88@qq.com
欧美三级精品在线观看| 冬爱琴音一区二区中文字幕| 国产传媒精品视频一区| 国产情侣激情在线对白| 东京热加勒比一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区区| 三级理论午夜福利在线看| 欧美成人一区二区三区在线| 日韩精品一级片免费看| 国产欧美韩日一区二区三区| 不卡免费成人日韩精品| 99久久国产综合精品二区| 国产精品免费视频视频| 国产欧美性成人精品午夜| 精品国产丝袜一区二区| 国产av天堂一区二区三区粉嫩| 国产大屁股喷水在线观看视频| 99视频精品免费视频| 国产精欧美一区二区三区久久| 国产高清精品福利私拍| 91国自产精品中文字幕亚洲| 欧美又大又黄刺激视频| 深夜福利欲求不满的人妻| 国语对白刺激高潮在线视频| 深夜福利亚洲高清性感| 久久精品国产99国产免费| 久久综合狠狠综合久久综合| 午夜精品久久久免费视频| 欧美一区二区黑人在线| 欧美日韩国产成人高潮| 国产精品香蕉免费手机视频| 爱在午夜降临前在线观看| 99福利一区二区视频| 国产成人精品午夜福利av免费| 亚洲国产精品国自产拍社区| 国产精品一区二区三区欧美| 欧美日韩国产成人高潮| 午夜日韩在线观看视频| 最新69国产精品视频| 午夜视频免费观看成人| 夫妻性生活动态图视频|