【摘要】：目的:從臍帶組織中提取并純化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),觀察并記錄其形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況;流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表型分析;探索在不同濃度的白藜蘆醇(Resveratrol)定向誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用與效率;觀察誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)變化,檢測(cè)突觸標(biāo)記物基因與蛋白表達(dá)水平,探索誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞的突觸可塑性,為hUC-MSCs體內(nèi)移植參與臨床治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病提供理論支持。方法:采用酶消法從臍帶組織中獲取原代hUC-MSCs。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hUC-MSCs表型。取P3代hUC-MSCs,隨機(jī)分為A、B、C、D四組,A、B、C、D組先加入預(yù)誘導(dǎo)液(含50ng/mL bFGF的Neurobasal medium)預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí),然后A、B、C組分別加入白藜蘆醇濃度為5mg/L/、10mg/L、20mg/L的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)1天,然后更換維持液繼續(xù)培養(yǎng)至7天,誘導(dǎo)液用Neurobasal medium配制,維持液用含2%B27、50ng/mL bFGF的Neurobasal medium配制。D組誘導(dǎo)時(shí)只加Neurobasal medium培養(yǎng)基誘導(dǎo)1天,再用含2%B27、50ng/mL bFGF的Neurobasal medium培養(yǎng)至7天作為對(duì)照。倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化,分別在誘導(dǎo)后的第1、2、3、4、5、6、7天每組隨機(jī)選取10個(gè)無重疊視野,采集圖像并統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)神經(jīng)樣細(xì)胞的百分比;免疫熒光染色檢測(cè)突觸素(synaptophysin,SYN)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth associated protein 43,GAP43)、突觸后致密物95(postsynaptic denstity protein 95,PSD95)的陽(yáng)性表達(dá)率,繼而選取誘導(dǎo)效果較為理想的一組,分別于誘導(dǎo)的第0、1、2、3、4、5、6天提取細(xì)胞總RNA及蛋白,用RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)SYN、GAP43、PSD95的表達(dá)情況。結(jié)果:1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P2、P8代細(xì)胞表型結(jié)果:表達(dá)CD105、CD90、CD73;不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR(MHC-Ⅱ)。2.免疫熒光染色檢測(cè)SYN、GAP43、PSD95表達(dá)的陽(yáng)性率,A、B、C、D四組SYN的陽(yáng)性率依次為0%、3.24±1.40%、49.32±2.85%、0%;GAP43的陽(yáng)性率依次為0%、3.16±1.42%、5.62±2.41%、0%;PSD95的陽(yáng)性率依次為0%、2.88±1.60%、41.75±2.08%、0%。結(jié)果顯示三種突觸標(biāo)記物的陽(yáng)性率均是C組最高,與其它各組相比有顯著差異(P0.01),因而選取C組細(xì)胞繼續(xù)做RT-PCR、Western Blot實(shí)驗(yàn)。3.RT-PCR檢測(cè)C組細(xì)胞在誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5、6天后SYN、GAP43、PSD95 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平,SYN的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平依次為0.386±0.026、0.446±0.011、0.462±0.014、0.515±0.016、0.523±0.029、0.558±0.028、0.516±0.034;PSD95的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平依次為0.055±0.013、0.170±0.017、0.265±0.018、0.290±0.016、0.327±0.023、0.291±0.020、0.269±0.020;GAP43的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平依次為0.082±0.018、0.112±0.014、0.119±0.012、0.124±0.017、0.399±0.020、0.559±0.017、0.387±0.019。結(jié)果顯示三種標(biāo)記物誘導(dǎo)后各時(shí)間組均與空白組有顯著差異(P0.01)。4.Western Blot檢測(cè)C組細(xì)胞在誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5、6天后SYN、GAP43、PSD95的蛋白相對(duì)表達(dá)量,SYN的相對(duì)表達(dá)量依次為0.185±0.017、0.346±0.027、0.535±0.035、0.598±0.026、0.678±0.037、0.657±0.031、0.585±0.034;GAP43的相對(duì)表達(dá)量依次為0.188±0.015、0.314±0.038、0.386±0.032、0.582±0.035、0.679±0.037、0.458±0.043、0.368±0.029;PSD95的蛋白相對(duì)表達(dá)量依次為0.065±0.020、0.303±0.036、0.397±0.032、0.497±0.041、0.649±0.053、0.489±0.060、0.263±0.025。誘導(dǎo)后各時(shí)間組相比空白組均有顯著差異(P0.01)。結(jié)論:1.從臍帶間質(zhì)中可成功分離純化hUC-MSCs,并能在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境下穩(wěn)定生長(zhǎng)及傳代。2.所得hUC-MSCs造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD11b、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR(MHC-Ⅱ)表達(dá)呈陰性;間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD105、CD90、CD73表達(dá)呈陽(yáng)性。3.20mg/L的白藜蘆醇可有效地將hUC-MSCs體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,并形成突觸樣結(jié)構(gòu),表達(dá)突觸標(biāo)記物SYN、GAP43、PSD95。4.hUC-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后具有形成突觸的物質(zhì)基礎(chǔ),為進(jìn)一步的細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)提供了理論支持。5.hUC-MSCs擁有向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力,可以作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病干細(xì)胞移植治療的細(xì)胞來源。
【圖文】：

hUC-MSCs原代培養(yǎng)2天，細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)（40×）

圖 1 hUC-MSCs 原代培養(yǎng) 2 天，細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)（40×）g.1 Primary hUC-MSCs were cultured for 2 days, and the cells wcolony-shaped
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2620729