本文關鍵詞：自噬參與清除Bcl-2抑制劑誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 本研究中，我們通過利用Bcl-2抑制劑誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)的清除方式，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)與自噬泡生成的聯(lián)系。 方法 利用免疫熒光檢測方法，觀測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的Bap31、Calnexin在細胞中的分布情況，代表內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的狀態(tài)，觀察藥物誘導Hela細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)。并利用ShRNA敲除技術沉默Hela細胞Bcl-2和Mcl-1基因，確認Bcl-2家族蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)的關系。利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑TUDCA，在不同時間點檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的表達，探討藥物誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激之間的關系。我們檢測了聯(lián)合給與Bcl-2抑制劑S1和ABT-737后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的表達量，同時加入自噬抑制劑3-MA來進一步確認，觀測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜被降解。通過高分辨率成像系統(tǒng)觀測免疫熒光蛋白標記的自噬標志蛋白Beclin-1，Atg-12，LC-3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白Calinexin，Bap31的分布，代表內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與自噬泡的位置，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)與自噬的關系。并利用加入自噬誘導劑雷帕霉素，自噬抑制劑CQ后觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)現(xiàn)象。 結(jié)果 Hela細胞在兩種Bcl-2抑制劑S1與ABT-737聯(lián)合給予4小時，增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)現(xiàn)象的發(fā)生。在聯(lián)合給予抑制劑后，發(fā)現(xiàn)細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白（Bap31/Calnexin）聚集。利用ShRNA敲除Hela細胞Bcl-2與Mcl-1基因后也發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)現(xiàn)象。另外，在Hela細胞聯(lián)合給予S1和ABT-737后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白Calnexin發(fā)生重構(gòu)并且隨著給藥時間的延長重構(gòu)加重。而在撤除S1和ABT-737后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)現(xiàn)象快速地緩解并最終消失。 檢測Hela細胞聯(lián)合給予Bcl-2抑制劑S1和ABT-737后，，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白Bip、eIF2a的蛋白表達，結(jié)果顯示表達上調(diào)，但是eIF2a的磷酸化水平并沒有明顯的變化，CHOP的蛋白表達下調(diào)。 在研究中我們發(fā)現(xiàn)Hela細胞給與Bcl-2抑制劑S1和ABT-7374小時顯著下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白Calnexin和Bap31。當加入自噬抑制劑3-MA，聯(lián)合給予S1和ABT-737后4小時，在3-MA作用下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白顯著回升，提示自噬有可能參加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的清除。 我們的后續(xù)研究結(jié)果顯示，Hela細胞在聯(lián)合給予Bcl-2抑制劑S1和ABT-737后自噬相關蛋白Atg12-Atg5復合體的表達量增加。與對照組比較，S1聯(lián)合ABT-737誘導Hela細胞自噬相關蛋白LC3-II表達量上升。S1聯(lián)合ABT-737誘導Hela細胞自噬相關蛋白Beclin-1的表達量上升。此外，S1聯(lián)合ABT-737給予后可以在Hela細胞中看到LC-3點狀聚集。 通過高分辨率成像系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜標志蛋白Calnexin,Bap31聚集，細胞自噬相關蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白有共定位。自噬激活劑雷帕霉素能夠恢復S1聯(lián)合ABT-737誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)。然而相反的，自噬抑制劑CQ對于S1聯(lián)合ABT-737誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)無明顯改變作用。 結(jié)論 聯(lián)合給與Hela細胞Bcl-2抑制劑S1與ABT-737可以誘導細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在時間點上是分離的。在Hela細胞給與S1和ABT-737后誘導細胞發(fā)生自噬，并且自噬會清除部分重構(gòu)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。
【關鍵詞】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Bcl-2家族蛋白 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu) 自噬
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R363.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 主要英文縮寫詞表11-12
• 引言12-14
• 第1章 文獻綜述14-24
• 1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變14-19
• 1.1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)、功能及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動態(tài)14-15
• 1.1.2 幾種已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學改變15-19
• 1.1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學改變19
• 1.2 Bcl-2 家族蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學改變19-22
• 1.2.1 Bcl-2 家族蛋白19-20
• 1.2.2 Bcl-2 家族蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學改變的關系20-21
• 1.2.3 Bcl-2 抑制劑21-22
• 1.3 自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變22-24
• 1.3.1 自噬22-23
• 1.3.2 自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學改變的關系23-24
• 第2章 材料和方法24-30
• 2.1 實驗材料24-26
• 2.1.1 主要試劑24-25
• 2.1.2 實驗儀器25-26
• 2.2 實驗方法26-30
• 2.2.1 細胞系培養(yǎng)26
• 2.2.2 細胞傳代26
• 2.2.3 細胞凍存26
• 2.2.4 細胞中總蛋白提取26-27
• 2.2.5 Bio-Rad 法測蛋白濃度27
• 2.2.6 Western blot27
• 2.2.7 Mcl-1、Bcl-2 shRNA 轉(zhuǎn)染實驗操作27-28
• 2.2.8 免疫熒光檢測28-29
• 2.2.9 統(tǒng)計學處理29-30
• 第3章 實驗結(jié)果30-41
• 3.1 S1 聯(lián)合 ABT-737 誘導 Hela 細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)30-33
• 3.2 S1 聯(lián)合 ABT-737 誘導 Hela 細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)在 UPR相關變化之前33-34
• 3.3 S1 聯(lián)合 ABT-737 下調(diào) Hela 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白34-36
• 3.4 S1 聯(lián)合 ABT-737 誘導 Hela 細胞發(fā)生自噬36-38
• 3.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)部分被自噬清除38-41
• 第4章 討論41-44
• 第5章 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-59
• 致謝59

  本文關鍵詞：自噬參與清除Bcl-2抑制劑誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重構(gòu)的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：261730