【摘要】：HER2蛋白屬于EGFR家族,可通過同源二聚體偶聯(lián),激活信號轉(zhuǎn)導通路,導致基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào),這些基因會促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。HER2在乳腺癌等多種惡性腫瘤細胞表面高表達,且HER2陽性乳腺癌惡性程度高,預后差,因此HER2被認為是抗腫瘤治療的重要靶點。親和體(Affibody)是一種經(jīng)人工篩選改造后的新型支架蛋白,由于其與抗原的結(jié)合類似抗原-抗體結(jié)合,因此有“人工抗體”之名。親合體分子量小,特異性強,親和力高,通常被用作生物成像的分子探針,或腫瘤治療性藥物的載體。近年來,腫瘤免疫治療成為了抗腫瘤研究領(lǐng)域的熱點之一。其中,嵌合抗原受體修飾NK細胞(CAR-NK)的免疫治療技術(shù),作為一種新型抗腫瘤免疫療法被廣泛關(guān)注。本文的創(chuàng)新點在于構(gòu)建了以可特異性識別并結(jié)合HER2的親合體Z_(HER2)作為嵌合抗原受體胞外結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒(Z_(HER2)-28ζ-pLVX-Puro),據(jù)我們所知,這是首次將親合體作為CAR胞外區(qū)。除此以外,本研究還構(gòu)建了1種以anti-HER2的人源化scFv為胞外區(qū)的第二代嵌合抗原受體修飾的NK-92MI細胞。我們首先在體外構(gòu)建了3種重組anti-HER2的慢病毒表達質(zhì)粒。其次,我們利用293TX細胞包裝了慢病毒顆粒并測定了滴度,然后利用超濾離心管或超速離心法濃縮了慢病毒顆粒。在轉(zhuǎn)染293TX細胞并進行嘌呤霉素篩選之后,在蛋白水平上,Western Blot實驗證明3種CAR蛋白的表達;而在細胞水平,利用免疫熒光和熒光成像評估CAR結(jié)構(gòu)的表達。此外,我們利用anti-HER2 scFv-28ζCAR慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染NK-92MI細胞系,并利用嘌呤霉素對CAR-NK細胞進行篩選,隨后用熒光成像驗證CAR結(jié)構(gòu)的表達,最后利用LDH釋放實驗評估其對HER2高表達乳腺癌細胞系的特異性細胞毒性,為anti-HER2 CAR-NK治療乳腺癌提供實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

可通過同源二聚體的偶聯(lián)激活信號轉(zhuǎn)導通路，從而導致一些特定基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，這些基因可以驅(qū)動細胞的增殖、遷移、分化和血管生成，并抑制細胞凋亡，促進細胞的存活[3]。HER2 蛋白在多種腫瘤細胞表面高表達，如：乳腺癌[4]、卵巢癌[5]、胃癌[6]、膠質(zhì)瘤[7]等，且與不良預后正相關(guān)，因此 HER2 蛋白被認為是抗腫瘤治療的重要靶點。1.1.2 乳腺癌發(fā)病情況簡介在中國，癌癥是導致死亡的主要原因[8]。據(jù)統(tǒng)計，中國女性新發(fā)病例排名第一的癌癥是乳腺癌，其后是肺癌和結(jié)直腸癌等[9]（見圖 1-1）。近 10 年來，女性乳腺癌的發(fā)病率顯著呈現(xiàn)出攀升的趨勢[10]，15~44 歲的女性群體是乳腺癌的高發(fā)人群[9]（見圖 1-1）；而從地域上講，城市女性罹患乳腺癌的概率高于鄉(xiāng)村女性[9]，，這可能與經(jīng)濟社會發(fā)展之后，肥胖人群的比例增加[11]，以及城市女性壓力大有關(guān)。Picon-Ruiz 等[12]報道了肥胖會導致促炎性因子在人體局部和體液循環(huán)當中促進腫瘤血管生成，并刺激大多數(shù)惡性腫瘤干細胞（CSC）群，驅(qū)動腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的研究。

與其他亞型相比，HER2 陽性乳腺癌表現(xiàn)為侵襲性更強，患者總生存期更短[14]�；� Slamon 等[15]的研究結(jié)果，針對 HER2 的人源化單克隆抗體（mAb）曲妥珠單抗被批準單獨或與化療聯(lián)合使用以治療乳腺癌，同時，這也是第一種被批準用于治療乳腺癌的生物制劑，顯示出罹患早期 HER2 陽性乳腺癌的患者化療后無病生存期（DFS）的改善。除曲妥珠單抗外，目前常用的治療 HER2 陽性乳腺癌的藥物包括：帕妥珠單抗[16]、小分子酪氨酸酶抑制劑拉帕替尼[17]以及抗體-微管抑制劑綴合物Ado-trastuzumab emtansine（T-DM1）[18]等。1.2 自然殺傷細胞簡介自然殺傷（NK）細胞是具有高抗腫瘤、抗病毒和抗微生物活性的先天性免疫系統(tǒng)的細胞，其殺傷腫瘤細胞的途徑主要包括：細胞毒作用、細胞因子的釋放、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）以及遺傳修飾（例如嵌合抗原受體修飾），如圖 1-2[19]所示。
【學位授予單位】：北京工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2616484