發(fā)布時(shí)間：2020-04-05 03:09

【摘要】：目的:神經(jīng)嵴干細(xì)胞(neural crest stem cells,NCSCs)是一種胚胎發(fā)育過程中具有多向分化潛能的細(xì)胞,可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)從神經(jīng)嵴分離,并分化出中樞與外周神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞等。目前大量的研究均著眼于NCSCs,但不同發(fā)育階段的NCSCs的形態(tài)和生物學(xué)功能不盡相同,但目前闡述不多,因此本實(shí)驗(yàn)首先觀察不同天數(shù)NCSCs的形態(tài)和體外增殖模式,為選取適宜的NCSCs提供依據(jù)。進(jìn)一步對(duì)不同天數(shù)大鼠NCSCs的上皮間質(zhì)特性進(jìn)行分析,選取EMT過程中常見的E-cadherin/N-cadherin作為目的基因,利用免疫熒光(Immunofluorescence,IF),Western blot及qRT-PCR技術(shù),對(duì)不同天數(shù)NCSCs中E-cadherin/N-cadherin表達(dá)水平進(jìn)行檢測,探討EMT在NCSCs遷移中的作用。研究方法:1、NCSCs分離培養(yǎng)健康成熟未孕的Wistar大鼠,雌雄大鼠按4:1比例午夜合籠,次日上午8:00做雌鼠陰道涂片,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)精子者確認(rèn)已交配,此日計(jì)妊娠0天(embryonic day0,E0)。選取E8.5,E9.5,E11,E13天的Wistar孕鼠,提取NCSC并培養(yǎng)傳代。2、細(xì)胞爬片及細(xì)胞HE染色。3、細(xì)胞免疫熒光染色、Western blot及qRT-PCR檢測不同天數(shù)大鼠NCSCs中E-cadherin/N-cadherin表達(dá)情況。4、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用2~(-△△ct)法分析目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化,觀察各天數(shù)細(xì)胞目的基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)。結(jié)果:1、培養(yǎng)不同天數(shù)的NCSCs利用DMEM/F12完全培養(yǎng)基成功培養(yǎng)出8.5、9.5、11、13天的NCSCs。2、不同天數(shù)NCSCs生長速度及HE染色結(jié)果小天數(shù)NCSCS細(xì)胞貼壁、聚集、成球速度較快,且傳代能力稍強(qiáng),可傳至4代左右。大天數(shù)NCSCs則相反,生長速度慢于小天數(shù)細(xì)胞,且傳代能力較弱,傳至3代時(shí)可見神經(jīng)嵴干細(xì)胞聚集及生長能力明顯減弱,難以聚集成簇形成神經(jīng)球。HE染色可見NCSCs細(xì)胞核較大,胞質(zhì)胞漿少,體外培養(yǎng)時(shí)可見細(xì)胞貼壁后,該類細(xì)胞相互靠近,排列緊密,呈集落狀生長,并最終形成神經(jīng)球懸浮。隨著原代細(xì)胞天數(shù)的增長可見細(xì)胞胞體及胞核稍減小,胞質(zhì)胞漿所占比例增多。3、免疫熒光染色、Western blot及qRT-PCR檢測E-cadherin/N-cadherin隨著NCSCs天數(shù)的增大,E-cadherin表達(dá)降低,N-cadherin表達(dá)升高。其中8.5天NCSCs中E-cadherin表達(dá)較明顯,9.5天、11天、13天表達(dá)明顯降低。N-cadherin表達(dá)趨勢(shì)與E-cadherin相反,8.5天N-cadherin表達(dá)不明顯,9.5天、11天、13天則表達(dá)明顯。結(jié)論:(1)NCSCs隨著原代細(xì)胞天數(shù)的增大,細(xì)胞形態(tài)及生長速度均存在一定的差異。天數(shù)越小,細(xì)胞核越大,胞質(zhì)越小,細(xì)胞生長相對(duì)越快,且傳代能力越強(qiáng)。(2)NCSCs生長過程中E-cadherin降低,N-cadherin升高的趨勢(shì)提示EMT在NCSCs遷移過程中起到重要作用,考慮NCSCs于胚胎發(fā)育的第8.5至9.5天之間發(fā)生EMT,進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞遷移。
【圖文】：

1E-cadherin在各天數(shù)NCSCs的免疫熒光染色E13

E-cadherin/N-cadherin 在不同天數(shù) NCSCs 中的表達(dá)情況3.4 qRT-PCR E-cadherin/N-cadherin mRNA 結(jié)果qRT-PCR 檢測顯示：與 E8.5 相比，E9.5、E11、E13 的 E-cadherin 的 mRNA表達(dá)水平明顯降低，，與此相反，N-cadherin 的 mRNA 表達(dá)水平則明顯升高（見表 3.4，圖 3.4）。表 3.4 E-cadherin/N-cadherin mRNA 表達(dá)量E8.5 E9.5 E11 E13in 1.1±0.6 1.8×10㧟4±1.2×10㧟42.3×10㧟3±1.2×10㧟36.9×10㧟3±4.5×in 3.4±4.1 7.5×103±1.2×1041.4×103±2.8×1024.6×102±2.5×
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R338

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張晶;丁軍利;劉超英;;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胰腺癌中的作用[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2015年24期

2 葉挺;蔣偉;逄旭光;王群;;肺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變現(xiàn)象的研究進(jìn)展[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年03期

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本文編號(hào)：2614452