【摘要】：肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引起的一類人畜共患慢性傳染疾病,嚴(yán)重威脅人類及患病動物的健康。目前,卡介苗仍然是世界范圍內(nèi)公認(rèn)的肺結(jié)核疫苗,但是由于地域、年限的差異導(dǎo)致卡介苗的保護效力不斷的下降,這可能是由于傳代過程中某些功能基因的缺失,因此人們積極尋求卡介苗的改良方法以期提高其保護力。結(jié)核分枝桿菌的RD-1區(qū)(Region of difference,1)是卡介苗同致病性分枝桿菌相比缺失的區(qū)域,由Rv3871-Rv3879c 9個基因構(gòu)成,RD-1區(qū)編碼的蛋白在結(jié)核分枝桿菌侵染機體的過程中發(fā)揮巨大的作用。隨著結(jié)核分枝桿菌基因組測序工作的完成,對結(jié)核分枝桿菌的研究進入分子水平,將RD-1區(qū)基因重組載體導(dǎo)入卡介苗表達(dá)蛋白或為肺結(jié)核疫苗的改良提供新的思路。本實驗首先運用分子生物學(xué)技術(shù)獲得大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體pMV261-RD-1區(qū)基因重組質(zhì)粒6個,利用電穿孔法將構(gòu)建成功的部分重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至卡介苗中,構(gòu)建重組卡介苗,經(jīng)培養(yǎng)得到重組卡介苗菌株。利用培養(yǎng)的重組卡介苗免疫動物,分別在免疫后的第6周和第12周對樣品進行檢測,通過檢測實驗動物脾淋巴細(xì)胞增殖情況,抗體水平變化情況以及小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子IFN-γ、NO含量來觀察小鼠體內(nèi)免疫情況并對數(shù)據(jù)進行分析,實驗結(jié)果如下所示:1、本實驗利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得6個RD-1區(qū)重組穿梭質(zhì)粒即pMV-261-Rv3872、pMV-261-Rv3873、pMV-261-Rv3874、pMV-261-Rv3875、pMV-261-Rv3876、pMV261-Rv3877。2、利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)成功獲得3個重組卡介苗即rBCG:ESAT-6、rBCG:EspI、rBCG:Snm4,重組卡介苗的生長曲線同卡介苗相比未發(fā)生明顯的變化,可以用于后續(xù)免疫實驗。3、免疫后每周稱量實驗動物的體重,發(fā)現(xiàn)注射卡介苗、重組卡介苗的小鼠同注射PBS組的小鼠相比,體重未發(fā)生明顯變化,注射的重組卡介苗沒有影響動物的生長。4、抗體效價檢測結(jié)果:免疫6周后,各實驗組組血清中IgG水平同PBS組相比均極顯著上升(P0.01),免疫12周后,抗體效價有所降低,BCG組及rBCG:ESAT-6組血清中IgG水平同PBS組相比顯著上升(P0.05)。rBCG:ESAT-6免疫動物血清的效價稍低于BCG組,但是能夠保持長時間的高水平抗體效價。5、脾淋巴細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明同PBS組相比,rBCG:ESAT-6組的脾淋巴細(xì)胞在受到PPD刺激時,能夠在免疫后第六周極明顯(P0.01)的刺激脾淋巴細(xì)胞增殖;免疫12周后,PPD刺激后rBCG:ESAT-6組SI(實驗組與對照組吸光度的比值,比值大于1則為陽性)極為顯著(P0.01),BCG組差異顯著(P0.05)。同PBS組以及BCG組相比,rBCG:ESAT-6組能夠維持較高的細(xì)胞免疫水平。6、INF-γ檢測結(jié)果表明:免疫6周、12周后,同PBS組相比較,各實驗組小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ的產(chǎn)量均顯著增加(P0.01)。7、NO檢測結(jié)果表明:免疫6周后,各實驗組的脾淋巴細(xì)胞受到PPD刺激時,NO的表達(dá)水平同PBS組相比均極為顯著(P0.01);免疫12周后,BCG組及rBCG:ESAT-6組的脾細(xì)胞受到PPD刺激時,NO的表達(dá)水平同PBS組相比均極為顯著(P0.01),rBCG:EspI、rBCG:Snm4組NO生成量差異顯著(P0.05)。
【圖文】：

白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致相應(yīng) T 細(xì)胞表位夠特異性應(yīng)對宿主壓力的抗原，參與了分枝桿菌逃分泌10 是 RD-1 區(qū)編碼的毒力蛋白，，能夠通過形成孔膜破 ESX-1(ESAT-6 secretion system-1)系統(tǒng)分泌。ESX-枝桿菌侵染宿主細(xì)胞的過程中調(diào)節(jié)分枝桿菌胞內(nèi)轉(zhuǎn)Snm2、EspI、Snm4、EsxC 作為 RD-1 區(qū)的四種蛋白識別、結(jié)合和分泌的作用進而輔助 ESAT-6、CFP-1

第二篇 研究內(nèi)容桿菌 RD-1 區(qū)部分基因重組穿件Primer5.0設(shè)計了結(jié)核分枝桿菌RD-1行合成。利用克隆技術(shù)獲得 RD-1 區(qū)基因重組穿梭載體，利用雙酶切和測序技873 、Rv3874、Rv3875、Rv3876、Rv38桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α 由本實驗室保存與流行病學(xué)中心提供。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2610563