【摘要】：目的:研究低氧預(yù)處理對人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)生物學(xué)特征的影響。方法:(1)應(yīng)用機(jī)械法和酶消化法從人羊膜組織中分離提取hAMSCs。(2)將傳代至P3代hAMSCs,設(shè)置低氧預(yù)處理組(3%O_2、5%CO_2)、常氧組(21%O_2、5%CO_2),均預(yù)處理48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。(3)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞儀(FCM)分別對低氧預(yù)處理組和常氧組hAMSCs進(jìn)行波形蛋白和免疫表型鑒定。(4)對低氧預(yù)處理組和常氧組hAMSCs進(jìn)行成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng),誘導(dǎo)3周后通過茜素紅和油紅O染色評價(jià)hAMSCs分化情況。(5)CCK-8(Cell Counting Kit-8)技術(shù)及Edu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測低氧預(yù)處理組和常氧組hAMSCs增殖活性及DNA合成率。(6)將低氧預(yù)處理組與常氧組細(xì)胞的hAMSCs分別在無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24小時(shí),通過Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞技術(shù)檢測hAMSCs凋亡情況。(7)將低氧預(yù)處理組和常氧組hAMSCs分別在無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24小時(shí),收集上清液,應(yīng)用Proteome Profiler(ARY 007)試劑盒檢測hAMSCs上清液中分泌血管生成相關(guān)因子含量。(8)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:(1)低氧預(yù)處理的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞與常氧培養(yǎng)的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察無明顯差異。(2)低氧預(yù)處理組與常氧組人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞波形蛋白均陽性表達(dá),PBS對照組陰性;兩組hAMSCs免疫表型FCM結(jié)果CD44、CD73、CD90、CD105均呈高表達(dá),CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR陰性,兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)低氧預(yù)處理組和常氧組人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞均具有成骨、成脂分化能力。(4)CCK-8結(jié)果顯示低氧預(yù)處理組和常氧組人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在1~7天的細(xì)胞增殖活性均先增加后降低,預(yù)處理組在1~7天增殖能力高于常氧組(P0.01);Edu增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,預(yù)處理組DNA合成率(29.50±3.53%)與對照組(16.55±0.78%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)AnnexinV-FITC/PI的FCM結(jié)果說明,在無血清培養(yǎng)條件下低氧預(yù)處理組人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(4.87±0.86%)與常氧組(12.31±1.14%)比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。(6)Proteome Profiler(ARY 007)結(jié)果顯示,低氧預(yù)處理組人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)下,上清液含有9種血管相關(guān)生長因子(Coagulation factor III、IGFBP、IL-8、MCP-1、Pentraxin E1、Serpin E1、Serpin F1、TIMP-1、Thrombospondin-2),常氧組含有8種(IGFBP、IL-8、MCP-1、Pentraxin E1、Serpin E1、Serpin F1、TIMP-1、Thrombospondin-2),其中IGFBP、Pentraxin E1、Serpin E1、Thrombospondin-2生長因子在預(yù)處理組含量(93.28±3.30、143.58±4.15、90.77±1.81、102.76±3.57)與常氧組(74.20±0.78、107.47±2.58、72.90±1.31、81.40±1.25)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:3%低氧預(yù)處理促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性、抗凋亡作用和旁分泌功能,并保持干細(xì)胞特性。
【圖文】：

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 代 敏2 結(jié)果2.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征倒置相差顯微鏡下觀察原代 hAMSCs 呈短梭形、橢圓形、多角形及不規(guī)則形，貼壁生長（圖 1A），2 天后首次換液，5～7 天細(xì)胞聚合度達(dá) 80%～90%（圖 1B）。原代 hAMSCs 中間雜著羊膜上皮細(xì)胞，經(jīng)過控制胰酶消化時(shí)間（2～3 min）方法可純化，傳代 1～2 代后的 hAMSCs 細(xì)胞形態(tài)有高度一致性，，基本呈長梭形，可見細(xì)胞呈放射狀、旋渦狀生長(圖 1C、D)。

圖 2.hAMSCs 常氧與低氧預(yù)處理 48 小時(shí)形態(tài)學(xué)特征Fig 2. Morphology characterization of hAMSCs after normoxic and hypoxic preconditioning for48 hoursA.21% O2濃度下第 3 代 hAMSCs 形態(tài)（×40）；B.3% O2濃度下第 3 代 hAMSCs 形態(tài)（×40）2.3 低氧預(yù)處理人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的表型鑒定2.3.1 低氧預(yù)處理 hAMSCs 免疫細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，N-hAMSCs 組與 Hp-hAMSC 組間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白均表達(dá)陽性（圖 3a、A），PBS 對照組陰性（圖 3b、B）。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 肖建輝;;人羊膜干細(xì)胞:再生醫(yī)學(xué)的理想種子細(xì)胞資源[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2015年05期

2 黃桂林;姜群;王天果;潘光華;王春宇;張霓霓;;損傷下頜下腺模型中涎腺干/祖細(xì)胞分離及特征的初步研究[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2009年02期

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1 劉林奇;低氧預(yù)處理的人脂肪來源干細(xì)胞促進(jìn)血管生成的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2610339