【摘要】：血管網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)復(fù)雜、精細(xì)的三維網(wǎng)絡(luò),負(fù)責(zé)為機(jī)體提供氧氣和能量的同時(shí)排出廢物,是生物體內(nèi)極其重要的組織器官。血管的過度生長(zhǎng)、減少或者功能障礙都可能導(dǎo)致多個(gè)系統(tǒng)發(fā)生病變。血管網(wǎng)絡(luò)在發(fā)育過程中盡管在不斷形成,但其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)卻在不斷簡(jiǎn)化,分級(jí)逐漸明顯�？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)血管網(wǎng)絡(luò)形成后的簡(jiǎn)化過程是由處于局部復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的血管融合或消失造成的,該過程也被稱之為血管修剪,近年來吸引了越來越多研究者的關(guān)注。通過利用小鼠視網(wǎng)膜血管、斑馬魚腦部血管、斑馬魚腸系膜血管等模型研究發(fā)現(xiàn),血管修剪這一過程是在血流動(dòng)力學(xué)因素的調(diào)控下,通過細(xì)胞的凋亡或重排等行為完成的。但是,至今為止還沒有課題組利用斑馬魚尾部血管的模型對(duì)其血管修剪過程以及參與這一過程的分子機(jī)制進(jìn)行研究�；谝陨峡茖W(xué)背景,本論文利用多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚和激光共聚焦顯微鏡、Morpholino敲降目的基因、Crispr/Cas9基因編輯技術(shù)等一系列實(shí)驗(yàn)方法對(duì)斑馬魚尾部血管的修剪過程以及參與其中的遺傳分子進(jìn)行了詳細(xì)的研究,本論文的主要內(nèi)容和研究結(jié)果如下:(1)斑馬魚尾部血管修剪過程的描述。首先利用激光共聚焦顯微鏡觀察斑馬魚尾部血管在發(fā)育過程中(1dpf到9.5dpf)的形態(tài)變化。然后用Tg(fli:nGFP×flk1:mCherry)轉(zhuǎn)基因斑馬魚統(tǒng)計(jì)其發(fā)育過程中尾動(dòng)脈、尾靜脈以及尾部靜脈叢的細(xì)胞數(shù)量,根據(jù)數(shù)量變化規(guī)律將尾部血管的修剪過程劃分為兩個(gè)主要階段:以血管融合為主的尾靜脈確定階段(1.5dpf至2.5dpf)、伴隨細(xì)胞遷移和凋亡的尾部靜脈叢退化階段(2.5dpf以后)。最后利用斑馬魚整胚免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了以上結(jié)論的正確性。(2)血流動(dòng)力學(xué)因素調(diào)控斑馬魚尾靜脈的形成。首先利用血流抑制劑tricaine對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行處理,通過激光共聚焦觀察到tricaine處理后斑馬魚胚胎的尾部靜脈叢不能很好地進(jìn)行融合形成正常的尾靜脈。然后利用Time-lapse慢速拍攝的方法對(duì)尾靜脈的確定過程進(jìn)行了連續(xù)24小時(shí)(48hpf至72hpf)的觀察,發(fā)現(xiàn)血流的有無能夠誘導(dǎo)相鄰靜脈血管之間的融合。以上結(jié)果表明,血流動(dòng)力學(xué)因素可以調(diào)控斑馬魚尾靜脈的形成。(3)klf6a作為力學(xué)感受器調(diào)控斑馬魚尾靜脈的形成。首先,通過體外力學(xué)加載的方法對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞施加不同大小的切應(yīng)力,培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)后進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn),篩選出了表達(dá)量隨切應(yīng)力的升高而顯著增加的Klf6。然后分別利用蛋白免疫印跡和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其力學(xué)感受作用。其次,特異性沉默和敲除斑馬魚klf6a基因后在胚胎發(fā)育至3dpf時(shí)利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)klf6a的缺失使得尾部靜脈叢在形成過程中無法正常進(jìn)行血管的融合與尾靜脈的形成,從而導(dǎo)致整個(gè)尾部血管的血流發(fā)生紊亂。根據(jù)以上結(jié)果我們得出結(jié)論,klf6a作為力學(xué)感受器調(diào)控斑馬魚尾靜脈的形成。本研究首次對(duì)斑馬魚尾部血管修剪過程進(jìn)行了詳細(xì)的描述,使其可作為一個(gè)新的血管修剪模型用于更多的研究。還篩選出了一個(gè)參與血管修剪過程的力學(xué)感受分子—Klf6,為后續(xù)更加深入的研究提供了方向。
【圖文】：

2 斑馬魚尾部血管的修剪過程2.2.2 斑馬魚的飼養(yǎng)與繁殖本課題中所用野生型斑馬魚 TU、AB，突變體斑馬魚 klf6a-/-，轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(flk1:GFP)（由清華大學(xué)孟安明院士實(shí)驗(yàn)室友情提供）和 Tg(nuclear:GFP)（由中國(guó)科學(xué)院大學(xué)動(dòng)物所劉峰教授實(shí)驗(yàn)室友情提供）等，均是在本實(shí)驗(yàn)室斑馬標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖的。該標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)由四大部分組成，包括：生物培養(yǎng)控制系統(tǒng)、養(yǎng)殖缸、系統(tǒng)水系統(tǒng)和純水系統(tǒng)，如圖 2.1 和圖 2.2 所示。

圖 2.2 豐年蟲的孵化與喂養(yǎng)。A：豐年蟲孵化缸。B：孵化出的豐年蟲。Figure 2.2 The hatching and feeding ofAnemia. A, Anemia hatching cylinder. B, Hatched anemia.按照斑馬魚標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)手冊(cè)的要求，將斑馬魚飼養(yǎng)系統(tǒng)的系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置如下：斑馬魚飼養(yǎng)間及系統(tǒng)水恒定控制在 28.5±0.5℃、明暗比為 14 小時(shí)/10 小時(shí)（系統(tǒng)晚22:00 自動(dòng)關(guān)燈，早 8:00 自動(dòng)開燈）、系統(tǒng)水 pH 為 7.0±0.2（pH 低于 7.0 時(shí)會(huì)影響斑馬魚產(chǎn)卵質(zhì)量，因此需每天測(cè)定系統(tǒng)水的 pH，當(dāng)發(fā)現(xiàn) pH 偏低時(shí)使用 NaHCO3將其調(diào)至正常）。系統(tǒng)水按照斑馬魚標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)手冊(cè)配制，配方如表 2.1 所示。成年斑馬魚的食物是豐年蟲，豐年蟲需在孵化缸中孵化出殼后才可以使用。孵化時(shí)，將豐年蟲卵、適量海鹽、一蒸水一起加入孵化缸中，攪拌均勻，然后插入增氧泵補(bǔ)充氧氣，持續(xù)增氧 24 小時(shí)后，大部分豐年蟲會(huì)卵殼分離，此時(shí)即可進(jìn)行喂養(yǎng)。喂養(yǎng)時(shí)取出增氧泵，孵化出的豐年蟲會(huì)慢慢沉到孵化缸的底部，拿盒子接出豐年蟲，，用流動(dòng)的純水反復(fù)沖洗、過濾豐年蟲，沖走滯留其中的鹽分以及多余的卵殼，最后用純水進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋后即可使用。喂養(yǎng)時(shí)，根據(jù)缸內(nèi)魚的數(shù)目，用吸管吸取不同量的豐年蟲擠入培養(yǎng)缸即可。豐年蟲孵化系統(tǒng)配方如表2.2。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R331

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊婧;王志堅(jiān);;斑馬魚胚胎早期血管系統(tǒng)的形成[J];生命的化學(xué);2009年02期

2 劉東;鐘濤;;斑馬魚血管系統(tǒng)的發(fā)育遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];國(guó)際遺傳學(xué)雜志;2008年02期

本文編號(hào)：2607051