【摘要】：脊髓灰質炎病毒(Poliovirus),簡稱脊灰病毒,屬微小核糖核酸(RNA)病毒科(Picomaviridae),是無包膜的單股正鏈RNA病毒。因為疫苗的接種脊髓灰質炎的流行得到了有效的控制,消滅脊灰后包括減毒株在內的所有活病毒都要被封存,在脊灰后時代探索脊灰假病毒評價人體免疫力的效果具有重要價值。本研究建立了構建Sabin II型的假病毒顆粒PVS2的方法,并對PVS2的生物學特性進行研究,確定其用于后續(xù)實驗的有效性,為后期利用假病毒進行中和實驗奠定了基礎。實驗研究中,通過同源重組法構建表達衣殼蛋白的質粒pcDNA-P1-S2和含有報告基因的骨架質粒pRepGL。然后分別利用體內和體外合成的Replicon制備假病毒:依次轉染 pcDNA-P1-S2 與由 pRepGL 體外轉錄的 Replicon RNA;共轉染 pcDNA-P1-S2、pRepGL和表達T7 RNA聚合酶的質粒pCAG-T7-puro,兩種方法得到的PVS2熒光素酶活性無顯著差異。從轉染試劑、培養(yǎng)基成份、293T的胞齡、質粒的比例4個方面進行探索后,PVS2的熒光素酶活性為1.2×105RLU。收獲的假病毒PVS2經鑒定是直徑約30 nm的顆粒,形態(tài)結構與原病毒相似,具血清特異性,可與中和抗體有效結合,制備的假病毒可以通過熒光素酶和熒光蛋白的活性檢測假病毒滴度,其中熒光素酶檢測靈敏度較高,用該方法檢測PVS2的滴度為4.0 LgIU/mL。同時以SabinⅡ型的replicon為母本,與SabinI型和III型的衣殼蛋白P1基因重配,獲得的重組病毒用不同型別的抗體檢測后確定具有血清特異性。綜上所述此次研究對轉染條件進行了探索并首次建立了運用胞內轉錄的Replicon RNA制備Sabin株脊灰病毒假病毒顆粒的方法,制備得到的Sabin假病毒顆粒PVS2的形態(tài)、血清型和抗原性與Sabin株活病毒相似;II型Replicon與SabinI型、III型的衣殼蛋白P1基因重配后獲得了具血清特異性的重組I、III型假病毒顆粒Re-PVS1、Re-PVS3。
【圖文】：

建逡逑表達質粒ｐｃＤＮＡ－Ｐｌ的構建逡逑炎Ｓａｂｉｎ株ＩＩ型病毒經過ＲＮＡ的提取，ＲＴ－ＰＣＲ獲得了Ｐ卜Ｓ２基因樣品為單一帶型且片段分子量大小與預期相符。因為設計引了與載體序列相重疊的序列，目的片段可以通過同源重組與ＦＰ邋（６１８０ｂｐ）相連接，連接好的質�？梢杂梦�。爪NB酶切后獲酶切的質粒（４道）為環(huán)狀結構，在電泳過程中分為了２個條粒超螺旋狀態(tài)的較多，適合用于轉染。在合成ＰＣＤＮＡ３．１－ＧＦＰ錢入了邋２Ａ酶切位點識別序列，保證蛋白在合成過程中ＧＦＰ與Ｐ１式存在。連接成功的質粒ｐｃＤＮＡ－Ｐｌ－Ｓ２經ＰＣＲ鑒定，ｆｃｏＲＶ示鑒定獲得片段分子量大小與預期一致，且測序結果顯示片段ＤＮＡ－Ｐｌ－Ｓ２圖譜見附件。逡逑

由質粒ｐＧＦＰ－Ｎｌ和ｐＮＬ４．３ＰＣＲ獲得，其分子量大小分別為７７７ｂｐ和１１４２ｂｐ。５ＵＴＲ和ＧＦＰ逡逑因分子量較小，可以通過重疊ＰＣＲ（邋ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ邋ＰＣＲ）進行連接，獲得的目的條帶５ＵＴＲ－逡逑ＧＦＰ的大小為１５２８邋ｂｐ，從圖１．２中可以看出在ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ邋ＰＣＲ產物雜帶較多，可能是因逡逑為引物特異性較差造成的非特異性擴增。為了保證條帶的特異性，回收時分別將兩條逡逑分子量接近的條帶回收，再用引物擴增鑒定。為了保證ＰＣＲ產物不發(fā)生突變同時也方便逡逑后續(xù)操作，５ＵＴＲ－ＧＦＰ，邋Ｐ２，邋Ｐ３三個部分的基因片段均經ＴＡ克隆后分別連接到Ｔ載體逡逑ｐＧＥＭＴ，邋ｐＭＤ１８－Ｔ上，測序正確后再進行連接反應。其中５ＵＴＲ－ＧＦＰ直接連接至［ＪｐＧＥＴ逡逑的Ｔ７啟動子后面，用于后續(xù)轉錄ＲｅｐｌｉｃｏｎＲＮＡ。用于連接的片段ｌｕｃ、Ｐ２、Ｐ３包含了與逡逑前后片段重疊的區(qū)域，所以多個目的片段可通過同源重組直接連接到線性化的ｐＧＭＥＴ－逡逑５ＵＴＲ－ＧＦＰ上，最終獲得質粒ｐＲｅｐＧＬ，，在該載體上目的基因按Ｔ７啟動子－５ＵＴＲ－ＧＦＰ２Ａ－逡逑Ｌｕｃ－Ｐ２－Ｐ３的順序連接
【學位授予單位】：北京協和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373.22

【參考文獻】

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1 袁志剛,張進平,儲以微,王纓,徐薇,熊思東;原核表達系統T7RNA聚合酶/啟動子在真核細胞中表達目的基因的實驗研究[J];生物工程學報;2005年02期

本文編號：2606721